微小核糖核酸與干細胞移植治療心肌梗死的研究進展

         摘要微小核糖核酸( miRNAs)是一種內(nèi)源性非編碼調(diào)控單鏈小分子核糖核酸，可通過與目標信使核糖核酸 ( mRNA)結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄后翻譯過程。有研究顯示miRNAs參與修復受損心肌。此外，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)不同的miRNAs可參與干細胞功能調(diào)控，調(diào)節(jié)干細胞存活、遷移、分化等過程，進而通過改善移植干細胞命運，提高心肌梗死后心功能。本文旨在對miRNAs與干細胞移植治療心肌梗死的研究現(xiàn)狀及所面臨的問題進行綜述。 
         關(guān)鍵詞心肌梗死；微小核糖核酸；干細胞移植；再生治療 
         冠狀動脈疾病在我國乃至全球發(fā)病率及死亡率都高居首位，其中心肌梗死是臨床常見急危重癥，目前的治療方法雖 然能顯著改善心肌梗死患者的臨床預后，但是因壞死的心肌 細胞難以再生，存活的心肌經(jīng)歷了缺氧及心臟重構(gòu)，致使心臟功能嚴重受損。目前干細胞移植治療心肌梗死，被認為是 再生壞死心肌細胞，修復梗死心肌具前景的治療方法，各種類型干細胞已用于實驗及臨床研究，然而不管何種類型干細胞均存在自身優(yōu)勢與局限性。骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療心肌梗死可顯著改善其心功能，然而也有研究顯示了骨髓間充質(zhì)干細胞分化為心肌細胞的不確定性，近期的幾個大型 臨床實驗中對骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療心肌梗死的確切療效亦無突破性進展。 胚胎干細胞及多能誘導干細胞是到 目前為止是具潛力替代壞死心肌的種子細胞源，但首先得解決其臨床應(yīng)用的安全性及倫理問題。心臟干細胞不僅可定向分化為心肌細胞、血管平滑肌細胞及內(nèi)皮細胞，并具有組織特異性與低免疫原性等特點。心肌損傷后，大部分心臟干 細胞即進入細胞周期、復制并定向分化為心肌細胞譜系，顯 著改善心肌梗死后心功能。且心臟干細胞在I/II期臨床試驗中均獲得可喜的成果。然而van Berlo等近期的一項 
         研究發(fā)現(xiàn)，成年及慢性疾病的小鼠心臟受損后，心臟固有干 細胞確實能產(chǎn)生出新的心肌細胞，但所占百分率僅為3%或 更低?？赡茉诟纳菩墓δ芊矫娌⒉痪哂酗@著性。由于心肌梗死后，心臟微環(huán)境變化極易導致移植干細胞發(fā)生凋亡，干細胞生物學利用率受限，減弱了其對心肌梗死的治療療效。因此，提高干細胞移植后的存活率及功能發(fā)揮將為轉(zhuǎn)化醫(yī)學發(fā)展與心臟疾病的防治開拓新的方向與策略。 
         1微小核糖核酸( miRNAs)的生物學特性 miRNAs作為新一代調(diào)控細胞命運的決定因素， 由Lee.等在秀麗線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，隨著對其結(jié)構(gòu)及生理活性的研究發(fā)現(xiàn)：miRNAs是由長鏈初級核糖核酸( pri-miRNA)在細胞核內(nèi)被核糖核酸酶Drosha剪切成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體(pre-miRNA)。隨后pre-miRNA在轉(zhuǎn)運因子Exponin-5的作用下進入細胞質(zhì)，在細胞質(zhì)內(nèi)被剪切成 20~24 nt的雙鏈miRNAs，雙鏈miRNA。在特異性解旋酶作 用下形成單鏈，從而成為成熟的miRNAs并在細胞質(zhì)內(nèi)表達其生理活性。miRNAs的作用機制是通過結(jié)合到目標mRNA的非編碼區(qū)( 3IUTR)，抑制靶標mRNA的翻譯從而起到重要的負性調(diào)控作用。 
         目前為止，在人類組織細胞中發(fā)現(xiàn)大 約有2 000個miRNAs參與調(diào)控人類總基因的30%—500-/0的表達。研究還發(fā)現(xiàn)，在不同組織不同細胞miRNAs的表達譜及序列特征均有所不同，甚至細胞不同發(fā)育分化階段均會出現(xiàn)miRNAs的差異表達，起到調(diào)控細胞“定時、定向”分化的作用。且每個miRNAs可同時有多個靶基因位點，而每個靶基因位點可能同時受多個miRNAs調(diào)控，可見miRNA。種類繁多，其靶基因位點及功能作用復雜多樣。 
         2 miRNAs與干細胞功能相關(guān)性 雖然目前各種成體多能干細胞，胚胎干細胞，及誘導重組 干細胞已成功用于治療缺血性心肌病并改善心梗后心功能一21。 然而干細胞移植治療心肌梗死仍處于初級階段，在臨床試驗 及動物模型實驗的長期觀察中發(fā)現(xiàn)：(1)各種類型干細胞均存 在移植存活率低的問題，尤其是從衰老機體或疾病狀態(tài)下獲 取的干細胞，其存活及功能障礙更為明顯；(2)心肌梗死后移植干細胞募集到梗死區(qū)及與原位細胞長期整合作用在目前的大多數(shù)研究均未見成效；(3)移植干細胞分化而來的功能 心肌細胞十分有限，是否能夠在體內(nèi)長期維持，疾病及衰老 狀態(tài)是否影響其心源性分化潛能目前均尚未得知。
         因此，現(xiàn) 已采取多種措施改善移植干細胞命運及功能，提高其修復梗死心肌的有效性。由于miRNAs參與調(diào)控基因表達網(wǎng)絡(luò)并具有容易被小分子干擾等特性，因此可用于干細的胞移植前處 理。近年來，隨著對miRNAs與干細胞的研究發(fā)現(xiàn)，在多種 干細胞中均存在各自特異的miRNAs表達，對干細胞的生物學活動具有重要的調(diào)控作用。以往研究顯示幾種miRNA。家族成員可維持胚胎干細胞的多能性，并且將不同的miRNA。 聯(lián)合過表達就足以誘導多能干細胞的產(chǎn)生；而一些miRNAs可部分抑制維持干細胞未分化狀態(tài)基因的表達，并激活干細 胞譜系特異性基因，發(fā)揮促進干細胞分化作用，此 外，干細胞所釋放的外泌體含有促進受損心肌組織修復的miRNAs。因此，干細胞的功能與miRNAs調(diào)控存在相 關(guān)性。事實上，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，不同的 miRNAs產(chǎn)生差異性表達，逆轉(zhuǎn)差異表達的miRNA。可能使冠脈疾病患者的細胞功能發(fā)生改變
         2.1 miRNAs促進移植干細胞存活 心肌損傷后釋放一系列炎癥因子及細胞因子，致使心臟微環(huán)境發(fā)生變化，極大影響了干細胞的存活，限制了移植細胞的功能發(fā)揮。近來的多項研究表明多種miRNA。家族成員 可促進心肌梗死后移植細胞存活。Huang等報道在小鼠心 肌梗死模型中，將過表達miRNA-126的骨髓間充質(zhì)干細胞 移植到心肌梗死區(qū)域，可促進新生血管形成，修復梗死心肌。 另有報道稱，過表達miRNA-21的骨髓間充質(zhì)干細胞，可通 過改善線粒體膜電位損傷從而促進缺血缺氧條件下骨髓間充 質(zhì)干細胞的存活。隨后Hu等的研究顯示，將分別攜帶miRNA-21、miRNA-24、miRNA-221的大鼠心臟干細胞在體外模擬的氧化應(yīng)激環(huán)境下凋亡減少，更有趣的是，同時過表達這三種miRNAs比單獨作用的抗凋亡能力強，其作用機制可能是與凋亡相關(guān)蛋白Bim結(jié)合，抑制其表達，從而發(fā)揮促細胞存活作用。此外，過表達miRNA-155可通過抑制受體相互作用蛋白1( RIPl)，進而激活蘇氨酸激酶(AKT)信號通路， 促進氧化應(yīng)激環(huán)境中心臟干細胞存活。由此可見，miRNA。 可增強移植干細胞抵御心梗局部缺血缺氧微環(huán)境的能力，為干細胞發(fā)揮生物學效應(yīng)奠定基礎(chǔ)。 
         2.2 miRNAs與干細胞遷移
         miRNAs不但能夠促進移植干細胞存活，一些miRNA。還參與調(diào)控移植干細胞的遷移作用?；|(zhì)衍生因子一1（SDF-1） 是CXC族趨化因子成員，可與其受體CXCR4相互作用，對干細胞遷移起關(guān)鍵作用。近年來研究顯示：miR\A-150與 miRNA-146其中一個靶mRNA即為CXCR4，兩者均可阻斷干細胞膜表面受體CXCR4翻譯過程，使SDF-l不能有效激活 CXCR4及其下游信號通路，削弱移植細胞遷移作用：因 此抑制這兩種miRNAs的表達可促進移植干細胞遷移至心梗區(qū)域，發(fā)揮修復梗死心肌作用。然而有報道稱m1RNA-150和 miNA-146可與多種凋亡相關(guān)蛋白結(jié)合，其高表達可對細胞存活作用產(chǎn)生積極的影響。MiRNAs對于生物體的調(diào)控作用是復雜多樣的，利用miRNAs治療疾病的過程中，需要權(quán)衡利弊：
         2.3 miRNAs促進干細胞分化 心肌缺血后再生壞死心肌細胞，建立有效的血運系統(tǒng)對保護心臟功能、改善遠期預后起關(guān)鍵作用。若只有新生心肌， 則會由于持續(xù)缺血而不能改善心功能；若只有新生血管而 無新生心肌，則不能產(chǎn)生收縮壓力。干細胞向心肌分化的過程是由一系列轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成的信號網(wǎng)絡(luò)通路調(diào)控，參與 該過程的miRNAs可對干細胞分化的各個環(huán)節(jié)進行微調(diào)。 可促進移植干細胞分化為心肌細胞及促進血管新生，修復壞死心肌組織。 miRNA-1是高度保守的miRNAs家族，也是迄今為止研究為廣泛的miRNAs之一。miRNA-1是肌特異性miRNA． 在胚胎干細胞體外擬分化為胚體的過程中，miRNA-1可加強其中胚層基因的表達，使其向心肌方向分化。Fu等發(fā) 現(xiàn)過表達miRNA-1不僅能夠促進胚胎干細胞分化為心肌細 胞，還能促進分化而來的心肌細胞的電生理成熟。隨后也繼 之報道過骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)染miRNA-1后，可通過抑制Notch信號通路的下游轉(zhuǎn)錄因子Hes-l而發(fā)揮促進骨髓間充 質(zhì)干細胞分化為心肌細胞的作用。Sluijter等研究認為 miRNA-1可通過下調(diào)組蛋白去乙?；?(HDAC4)表達而促進人心臟前體細胞向心肌細胞分化。此外，Richart等將胚胎源性心臟干細胞( SSEAI+/MESPI+)移植到小鼠心肌梗死 區(qū)域，可顯著促進新生血管形成，而在該類型心臟干細胞中 miRNA-21高表達，可以認為miRNA-21可促進心臟干細胞的血管新生作用。 
         2.4 miRNAs與干細胞旁分泌效應(yīng) 大量研究證實心肌受損后移植干細胞可通過直接分化作 用改善心功能，但是由于干細胞分化的心肌細胞數(shù)量有限，不足以替補心臟受損丟失的細胞數(shù)量，因此，不能單純用直接分化機制解釋干細胞再生修復受損心肌的作用。有學者認為干細胞不但可以直接再生心肌組織，而且還能通過旁分泌 效應(yīng)。增加細胞因子的表達，促進血管再生。并有報道稱干細胞的旁分泌效應(yīng)大于干細胞的直接分化作用。 對干細胞旁分泌作用的新研究發(fā)現(xiàn)，多種干細胞可釋 放一種納米級膜性小囊泡，稱為外泌體，對細胞之間的相互作用至關(guān)重要。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的外泌體中包含了相關(guān)miRNA。達764種。這些源于外泌體的miRNAs在調(diào)控干細胞分化（let-7，即miRNAs成員之一）、胚胎發(fā)育和器官發(fā)生（miRNA-1）、腫瘤 發(fā)生（miRNA-17-18/-19/19b）等生理和病理生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。30，311。Chen等發(fā)現(xiàn)，心肌祖細胞的外泌體中富含miRNA-451，將心肌細胞與含該外泌體的培養(yǎng)基中共培 養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，心肌細胞內(nèi)的miRNA-451含量增加，且細胞對 缺氧的耐受增強，由此證明心肌細胞可以內(nèi)化心臟祖細胞釋 放的外泌體，并利用miRNA-451啟動細胞內(nèi)信號通路而減少缺血再灌注心肌細胞的凋亡，促進損傷細胞的修復。 
        

          3面臨的問題及展望
         目前干細胞介導治療心肌梗死面臨著移植存活率低， 作用機制不確定性等問題，但干細胞的臨床應(yīng)用前景仍然擁 有非常巨大的研究價值。miRNAs作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵分子，對干細胞的生物學功能起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。近年來大 量關(guān)于miRNAs改善于細胞療效的試驗研究取得可喜成果， 但仍存在許多問題。首先，盡管miRNAs的抑制靶基因表達的作用非常強，但若需要過表達或抑制相關(guān)miRNA。需要實施轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?，即建立有效的小分子或病毒作為載體。雖然 近年來利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)治療疾病已受到很大關(guān)注，歐洲國家 亦批準了個基因療法，并且以病毒作為載體治療心臟病的基因療法被證實是安全有效的。然而大規(guī)模的臨床應(yīng)用還需要經(jīng)過一個漫長的階段。其次，miRNA。的生物學功能 還遠遠未能被人類所了解，作為一種普遍存在的調(diào)控分子， 后續(xù)研究將會發(fā)現(xiàn)更多的miRNAs，進一步闡明其靶基因位點和功能，以便確定對整個基因網(wǎng)絡(luò)的全面影響是亟待解決的問題。后，目前對miRNAs靶基因的預測多是通過生物信息軟件來完成，因此仍需進行充分的生物學實驗來證實。 盡管應(yīng)用miRNAs調(diào)控干細胞生物學功能面臨諸多挑 戰(zhàn)，但它對改善干細胞治療缺血性心肌病的作用是有目共睹的，相信隨著研究的進一步深入，上訴問題均會得以解決對miRNAs的了解也必將越來越全面和準確，這將為生命科 學研究和臨床應(yīng)用miRNAs介導干細胞治心肌梗死開啟新的 時代。  
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         (收稿日期：2015-04-16） （編輯：王寶茹）