微小RNA-542-3p在膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移中的作用研究

微小RNA( miRNA，miR) -542-3p是近年來(lái)研究的一個(gè)非編碼RNA，文獻(xiàn)報(bào)道其可抑制腸癌細(xì)胞的遷移能力…。本研究旨在探討其在膀胱癌中的表達(dá)及其生物學(xué)功能。
一、資料與方法

1．臨床資料：手術(shù)治療的膀胱癌患者36例，術(shù)中留取患者癌組織及癌旁組織標(biāo)本，迅速置入液氮中冷凍，防止RNA降解，然后置入- 80℃冰箱保存待檢。36例膀胱癌患者中男22例，女14例，平均年齡( 56.3±16.5)歲，世界衛(wèi)生組織(WHO)腫瘤分級(jí)Gl級(jí)15例，G2級(jí)12例，G3級(jí)9例。國(guó)際抗癌聯(lián)盟( UICC)臨床分期標(biāo)準(zhǔn)：Tis/Tl期16例，T2~ T4期20例。腫瘤初發(fā)者28例，復(fù)發(fā)者8例。
2．試劑與儀器設(shè)備：Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogene公司；m1R-542-3p mimic和control由廣州銳博公司合成。7900HT實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)( Real-time PCR)儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。
3．Real-time PCR:提取癌組織、癌旁組織及膀胱癌T24細(xì)胞中的總RNA．采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進(jìn)行miR-542-3p表達(dá)水平檢測(cè)。 4．細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒( CCK-8)實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染m1R-542-3p-mimic及miR-542-3p-control的T24細(xì)胞按5 000個(gè)／孔接種子96孔板，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，于接種后24、48、72、96 h，按照CCK-8試劑盒說(shuō)明，檢測(cè)細(xì)胞增殖。于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每組細(xì)胞的吸光度(A)值。取6孔平均值為結(jié)果，以時(shí)間為橫軸，A值為縱軸繪制細(xì)胞增殖曲線。
5．劃痕實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)T24細(xì)胞的6孔板中轉(zhuǎn)染miR-542-3p—mimlc及m1R-542-3p-control的細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，用1 000μl槍頭進(jìn)行垂直劃線，一個(gè)孔分為上、中、下劃3條，用PBS清洗，在顯微鏡下選取特定位置拍照作為原點(diǎn)。于48 h后分別再次拍照對(duì)應(yīng)位置，作圖處理并統(tǒng)計(jì)傷痕變化。
6．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±5）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P <0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
二、結(jié)果
1．m1R-542-3p在膀胱癌／癌旁組織中的表達(dá)：36對(duì)配對(duì)癌組織與癌旁組織中m1R-542-3p表達(dá)高于正常組織者為7例(19.4%)，而正常膀胱組織表達(dá)高于癌組織者為29例(80.6%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X=5.180，P=o．000)。
2．miR-542-3p與細(xì)胞增殖：在膀胱癌細(xì)胞株T24轉(zhuǎn)染m1R-542-3p-mimic及m1R-542-3p-control 96 h后其細(xì)胞A490值分別為1. 33±0.12和1.21±0.11，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.650，P=0. 100)。
3．miR-542-3p與膀胱癌侵襲轉(zhuǎn)移：在膀胱癌細(xì)胞株T24轉(zhuǎn)染miR-542-3p-minuc及m1R-542-3p-control 48 h后兩組細(xì)胞的遷移距離分別為( 318.6±32. 4) μm和(397.2±26.8)μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(f=4. 180，P=0.003)。
三、討論
miR-542-3p早于2010年被發(fā)現(xiàn)，可靶向生存蛋白Survivin的3’端非編碼區(qū)域（3’-UTR）抑制其mRNA和蛋白表達(dá)，從而在肺癌細(xì)胞株A549中阻斷細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增殖[2]。此外，m1R-542-3p在腫瘤細(xì)胞中加強(qiáng)p53蛋白穩(wěn)定性、抑制核糖體合成，是其抑制惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的另一個(gè)可能機(jī)制。以上研究結(jié)果表明miR-542-3p同惡性腫瘤發(fā)展密切相關(guān)。
本研究結(jié)果顯示，膀胱癌旁組織高表達(dá)頻率顯著高于癌組織。說(shuō)明miR-542-3p在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要的負(fù)向調(diào)節(jié)作用，其缺失／低表達(dá)可能是膀胱癌發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。同時(shí)，在膀胱癌T24細(xì)胞中過(guò)表達(dá)m1R-542-3p后，膀胱癌rl24細(xì)胞的增殖能力并無(wú)明顯變化，而其遷移能力明顯降低，說(shuō)明nuR-542-3p能夠顯著抑制膀胱癌T24細(xì)胞的遷移。