高良姜中二苯基庚烷A的含量測(cè)定及指紋圖譜研究

【摘要】  目的 建立高良姜藥材中二苯基庚烷A的含量測(cè)定方法及藥材的指紋圖譜。方法 采用RPHPLC法進(jìn)行測(cè)定，色譜柱：C18柱（150 mm×4.6 mm,5 μm）； 流動(dòng)相：甲醇水(體積比71∶29)；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm。結(jié)果 15批高良姜藥材經(jīng)中藥色譜指紋圖譜評(píng)價(jià)軟件分析，確定6個(gè)共有峰作為指紋特征峰。結(jié)論 二苯基庚烷A含量測(cè)定及指紋圖譜的建立，為高良姜藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】  高良姜　二苯基庚烷A　HPLC　指紋圖譜

　　Contents and fingerprints of diphenylheptane A in Rhizoma Alpiniae Officinarum 

　　CUI Weili, FENG Yifan, GUO Xiaoling, MENG Qing

　　(Institute of Materia Medica，Guangdong College of Pharmacy，Guangzhou 510006，China)

　　Abstract:ob[x]jective  To analyze the contents and establish the fingerprints of diphenylheptane A in Rhizoma Alpiniae Officinarum.  Methods Samples were analyzed on an HPLC column (150 mm×4.6 mm, 5 μm) by using methanolwater (71∶29) as mobile phase. Results Fifteen bathes of extracs from Rhizoma Alpiniae Officinarum were analyzed by Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation software, and 6 copeaks were identified as fingerprints. Conclusions The method can be used for the quality control of Rhizoma Alpiniae Officinarum.

　　Key words: Rhizoma Alpiniae Officinarum; diphenylheptane A; HPLC; fingerprint

　　高良姜為姜科山姜屬植物高良姜(Alpinia officinarum Hance)的干燥根莖，其性熱味辛，歸脾、胃經(jīng),具溫胃散寒、消食止痛的功效，用于脘腹冷痛、胃寒嘔吐、噯氣吞酸等［1］。高良姜中的二苯基庚烷類化合物具有鎮(zhèn)痛抗炎，抗氧化等多種生理活性，廣泛應(yīng)用于炎癥、潰瘍、血栓等的預(yù)防與治療［2,3］。目前國(guó)內(nèi)尚未見以二苯基庚烷類化合物含量測(cè)定作為控制高良姜藥材質(zhì)量的研究報(bào)道。本研究建立了高良姜藥材中二苯基庚烷A［1苯基7(3′甲氧基4′羥基)苯基5醇3庚酮］的含量測(cè)定方法，并應(yīng)用評(píng)價(jià)軟件《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004年A版》，建立了高良姜的HPLC色譜指紋圖譜，以此作為高良姜藥材質(zhì)量控制的依據(jù)。結(jié)果表明該方法可操作性強(qiáng)，重復(fù)性好，可比較不同產(chǎn)地高良姜藥材的內(nèi)在質(zhì)量差別。

　　1  儀器與試藥
   
　　Waters 26952996高效液相色譜儀,Empower工作站； BP210 D型十萬(wàn)分之一天平(德國(guó)Sartorius公司)；DL360A超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)；評(píng)價(jià)軟件《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004年A版》（中國(guó)藥典委員會(huì)）。
   
　　二苯基庚烷A對(duì)照品［自制，按HPLC面積規(guī)一化法計(jì)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.0％］；甲醇(色譜純)；三蒸水；石油醚（60～90 ℃）。各批號(hào)高良姜藥材為各地收集的市售產(chǎn)品，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)李衛(wèi)民教授鑒定均為姜科植物高良姜的根莖。

　　2  方法與結(jié)果

　　2．1  溶液的制備

　　2．1．1  對(duì)照品溶液的制備
   
　　取二苯基庚烷A對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1.034 mg/mL的溶液，搖勻，作為儲(chǔ)備液，再精密吸取上述儲(chǔ)備液1 mL，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋并定容，得到質(zhì)量濃度為103.4 μg/mL的對(duì)照品溶液。

　　2．1．2  供試品溶液的制備
   
　　取各批號(hào)的高良姜藥材，粉碎后過(guò)40目篩，取粉末1 g，精密稱定，置50 mL錐瓶中，加石油醚（60～90 ℃）20 mL超聲提取3次，每次超聲5 min，過(guò)濾，棄去濾渣，合并濾液，揮干溶劑，加甲醇溶解并定容到50 mL量瓶中，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

　　2．2  色譜條件
   
　　色譜柱：SunfireTM C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇水(體積比71∶29)；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。對(duì)照品與樣品的色譜圖見圖1。

　　圖1  對(duì)照品(A)、樣品(B)的HPLC色譜圖（略）

　　Fig.1  HPLC chromatogram of standard(A) and sample(B)

　　2．3  方法學(xué)考察

　　2．3．1  標(biāo)準(zhǔn)曲線
   
　　分別精密吸取質(zhì)量濃度為103.4 μg/mL的二苯基庚烷A對(duì)照品溶液2、6、10、12、16、20 μL進(jìn)樣。以峰面積(A)對(duì)二苯基庚烷A的質(zhì)量（m）回歸，得回歸方程A=1.721×106m-9×103，r=0.9998，表明二苯基庚烷A在0.2068～2.068 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

　　2．3．2  精密度試驗(yàn)
   
　　精密吸取質(zhì)量濃度為103.4 μg/mL的二苯基庚烷A對(duì)照品溶液10 μL，分別進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)RSD為0.22％，表明本試驗(yàn)精密度良好。

　　2．3．3  重復(fù)性試驗(yàn)
   
　　取批號(hào)為20030220的高良姜藥材，精確稱取6份，按“2．1．2”項(xiàng)下處理，測(cè)定其二苯基庚烷A的含量，二苯基庚烷A的含量為0.48％，RSD為2.19%，表明本試驗(yàn)重復(fù)性良好。

　　2．3．4  穩(wěn)定性試驗(yàn)
   
　　精密稱取取批號(hào)為20030220的高良姜藥材，按“2．1．2”項(xiàng)下處理，在12h內(nèi)分別測(cè)定二苯基庚烷A的含量，二苯基庚烷A的含量為0.49%，RSD為0.40％（n＝6），表明供試品溶液12h內(nèi)較穩(wěn)定。

　　2．3．5  加樣回收率試驗(yàn)
   
　　取批號(hào)為20030220的高良姜藥材粉末0.5 g，精密稱定，精確加入二苯基庚烷A對(duì)照品2.61 mg(質(zhì)量濃度1.305 mg/mL，加入2 mL)，按“2.1.2”項(xiàng)下處理，取10 μL進(jìn)樣。結(jié)果見表1。

　　表1  回收率試驗(yàn)（略）

　　Tab.1  Result of recovery test(n=6)

　　2．3．6  高良姜藥材中二苯基庚烷A的含量測(cè)定
   
　　按照上述條件，分別對(duì)各批號(hào)的高良姜藥材進(jìn)行分析，并算出二苯基庚烷A的含量，結(jié)果見表2。

　　2．4  高良姜藥材的HPLC指紋圖譜
   
　　將S1～S15共15批高良姜藥材提取物的色譜數(shù)據(jù)載入相似度評(píng)價(jià)軟件，經(jīng)軟件分析計(jì)算確定出6個(gè)共有峰作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立了15批高良姜藥材提取物的指紋圖譜（相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見圖2，表3），并生成HPLC參照指紋圖（見圖3）。色譜圖中，在3.089，3.503，4.007，6.313，8.109和17.401 min處分別有明顯的色譜峰，這6個(gè)色譜峰為高良姜脂溶性成分的主要特征色譜峰和共有色譜峰。

　　圖2  高良姜藥材指紋圖的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果（略）

　　Fig.2  Similarity evaluation of the fingerprints of Rhizoma Alpiniae Officinarum

　　表2  樣品中的二苯基庚烷A含量（略）

　　Tab.2  The content of diphenylheptane A

　　表3  高良姜藥材指紋圖的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果（略）

　　Tab.3  Similarity evaluation of the fingerprints from the extracts of Alpinia officinarum Hance

　　圖3  高良姜藥材的HPLC參照指紋圖譜（略）
 
　　3  討論

　　3.1  本研究采用液相色譜質(zhì)譜（LCMS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)高良姜石油醚提取物進(jìn)行分析，鑒定圖1B中4個(gè)色譜峰分別為二苯基庚烷A［1苯基7(3′甲氧基4′羥基)苯基5醇3庚酮，峰2］，二苯基庚烷B［1苯基7(3′甲氧基4′羥基)苯基4烯3庚酮，峰4］，二苯基庚烷C［1，7二苯基5醇3庚酮，峰5］和二苯基庚烷D［1，7二苯基5甲氧基3庚酮，峰6］。

　　3.2  取批號(hào)為20030220的高良姜藥材粉末考察提取次數(shù)對(duì)二苯基庚烷A含量的影響，結(jié)果顯示，藥材提取1，2，3，4次(每次超聲5 min)，二苯基庚烷A含量分別為(0.365±0.008)％，(0.452±0.005)％，(0.479±0.003)％，(0.484±0.005)％(n=3)，表明二苯基庚烷A已經(jīng)被提取完全。故采用超聲提取3次，每次5 min的方法制備供試品溶液。

　　3.3  本研究在建立高良姜藥材的HPLC指紋圖譜時(shí)發(fā)現(xiàn)，批號(hào)20070825的高良姜只有3.409和8.262 min兩個(gè)色譜峰，且二苯基庚烷A含量偏低（見圖4），故未將其列入指紋圖譜之中。

　　圖4  海南產(chǎn)高良姜的HPLC圖（略）

　　Fig.4  HPLC chromatogram of Rhizoma Alpiniae Officinarum from Hainan Province

　　3.4  以上不同產(chǎn)地15個(gè)批號(hào)高良姜藥材的HPLC指紋圖譜表明，不同產(chǎn)地的高良姜藥材HPLC色譜峰，均以二苯基庚烷A為主要的色譜峰。從二苯基庚烷A的含量測(cè)定結(jié)果來(lái)看，不同批號(hào)藥材中二苯基庚烷A的含量差別較大，大相差4.5倍。

　　3.5  本文所建立的高良姜中二苯基庚烷A的含量測(cè)定方法及指紋圖譜，可以作為高良姜藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)和藥材篩選的依據(jù)。建議在藥材篩選時(shí)，應(yīng)選擇包含所有特征峰且二苯基庚烷A含量較高的藥材。

 

【參考文獻(xiàn)】
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作者：崔維利

作者單位：廣東藥學(xué)院 中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006