人正常胃黏膜細(xì)胞全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及鑒定

【摘要】  目的 構(gòu)建人正常胃黏膜細(xì)胞的cDNA文庫(kù)并鑒定文庫(kù)質(zhì)量。方法 運(yùn)用mRNA 5′末端的模板轉(zhuǎn)換方法以powersc[x]ript 逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,在mRNA的5′末端添加一段5′oligo 做為延伸后的模板,從而富集全長(zhǎng)cDNA.擴(kuò)增后的cDNAs經(jīng)XhoI酶切、柱層析洗脫,重組于pGADT7載體并包裝后,測(cè)定滴度、重組率,擴(kuò)增文庫(kù)。隨機(jī)挑取16個(gè)克隆行PCR 反應(yīng)擴(kuò)增插入片段。結(jié)果 構(gòu)建的cDNA 文庫(kù)滴度為4.00 ×106 pfu/ml,重組率>95%,擴(kuò)增后滴度達(dá)9.50×109 pfu/ml,16個(gè)插入片段長(zhǎng)度為0.5～2.0 kb.結(jié)論 構(gòu)建的人正常胃黏膜細(xì)胞cDNA文庫(kù)為高效全長(zhǎng)的酵母雙雜交cDNA 文庫(kù),符合cDNA 文庫(kù)的要求,可進(jìn)一步用酵母雙雜交的方法探尋與胃疾病相關(guān)的基因。

【關(guān)鍵詞】  胃黏膜細(xì)胞;cDNA文庫(kù);全長(zhǎng)

Construction and identification of a cDNA library of human gastric mucosa

　　HE Zhen1,XIE Yubo2,XIAO Qiang1

　　(First Affiliated Hospital of Guanxi Medical University,1.Department of Gastrointestinal Gland Surgery,2.Department of Anesthesiology,Nanning 530021,China)

　　【Abstract】 ob[x]jective To construct a fulllength cDNA library of human gastric mucosa and identify the quality of the library.Methods The library was constructed by using the templateswitching technique at 5′ end of mRNA.A powersc[x]ript reverse transc[x]riptase was used to transcribe,and a 5′ oligo fragment as an extended template was added t o 5′end of mRNA to enrich fulllength cDNAs.After amplification,the cDNAs digested by XhoI and sizefractionated by columns were recombined into pGADT7 vectors.After package,the titer of recombinant vectors and the recombinant rate(blue/ white)were determined,then the library was amplified.We identified the library using PCR reaction to determine the size of the inserts.Results The titer of cDNA library was 4.00 ×106pfu/ml,the rate of recombinant was above 95 %,and the titer of amplified library was 9.50×109pfu/ml.The insert size ranged from 0.5 to 2.0 kb.Conclusion The yeast twohybrid cDNA library of human gastric mucosa is successfully constructed and can be used for screening by Yeast TwoHyBrid to find the genes related to gastric diseases.

　　【Key words】 gastric mucosa;cDNA library;fulllength

　　隨著人類基因組計(jì)劃的初步完成,確定不同發(fā)育階段的功能基因成為后基因組時(shí)代的重要研究?jī)?nèi)容,而構(gòu)建cDNA文庫(kù)已成為研究功能基因組學(xué)的基本手段之一,在分離、克隆、篩選新基因以及基因功能研究等方面具有重要作用[1]。本研究以pGADT7為表達(dá)載體,構(gòu)建了一個(gè)人正常胃黏膜細(xì)胞全長(zhǎng)cDNA 表達(dá)文庫(kù),為今后胃疾病相關(guān)基因的研究工作奠定了基礎(chǔ)。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　人GES1細(xì)胞于2009年6月18日購(gòu)自中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室。Trizol提取試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒、PCR TaqMix試劑盒、OligotexdT30 mRNA Purification kit購(gòu)自大連寶生物科技有限公司;其他生化試劑購(gòu)自國(guó)內(nèi)生物公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 總RNA提取及poly(A)+RNA純化 細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37℃,5%CO2的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)至旺盛生長(zhǎng)期,傾盡培養(yǎng)液后直接向培養(yǎng)瓶中加入Trizol試劑(1 ml/10 cm2),裂解細(xì)胞,并用吸頭將細(xì)胞裂解物吹吸幾次,再經(jīng)氯仿抽提及異丙醇沉淀后,以75%乙醇洗滌,室溫自然干燥,干燥后溶于三蒸水中(DECP處理),并在55～60℃放置10 min讓其充分溶解。取出一小份稀釋后在紫外分光光度計(jì)下測(cè)RNA含量及純度,并做瓊脂糖凝膠電泳分析總RNA完整性。以O(shè)ligotexdT30 mRNA Purification kit進(jìn)行mRNA分離純化,實(shí)驗(yàn)步驟按說明書進(jìn)行。

　　1.2.2 鏈cDNA 的合成 將模板RNA(Poly(A)+ RNA)5 μg中加入H2O,使其總量達(dá)到9.8 μl,于72 ℃孵育2 min,冰中放置2 min后在微量離心管中加入5×1st Strand Synthesis Buffer 4 μl、1st Strand dNTP Mixture 1.2 μl、RNase Inhibitor(20 U/μl)1.0 μl、1 μg /μl Oligo(dT)18 Anchor Primer[序列為5'(GA)10ACTAGTCTCGAG(T)18V3'(V:A or C or G)]2.0 μl于室溫放置10 min后加入Reverse Transc[x]riptase(MMLV)1.0 μl,輕輕混勻,于 42 ℃孵育60 min,向反應(yīng)管中加入200 U/μl Supersc[x]ript III RTase 1 μl,52 ℃孵育60 min,反應(yīng)結(jié)束后置于冰中冷卻2～5 min.

　　1.2.3 雙鏈cDNA合成 在鏈cDNA合成液(20 μl)中加入5×2nd Strand Synthesis Buffer 30 μl、2nd Strand dNTP Mixture 4.5 μl、RNasefree H2O 87.5 μl、E.coli RNase H/E.coli DNA Ligase Mixture 2 μl、E.coli DNA PolymeraseⅠ2 μl.用移液槍輕輕混勻后,16 ℃反應(yīng)2 h,70 ℃加熱10 min,室溫放置5 min,加入4 μl的T4 DNA Polymerase輕輕攪拌,37 ℃反應(yīng)10 min.經(jīng)PCI抽提、CI抽提后,加入3 M Sodium Acetate(pH5.2)15 μl,Dr.GenTLE Precipitation Carrier 3 μl,乙醇400 μl,立即進(jìn)行室溫下15 000 r/min共30 min的離心。除去上清后用70%的乙醇清洗,干燥沉淀后,用3.5 μl的 RNasefree H2O溶解沉淀。

　　1.2.4 cDNA與sal Ⅰ adaptor的連接 向上述雙鏈cDNA溶液3.5 μl中加入下列試劑:10×T4 DNA Ligase Buffer 1 μl,0.4 μg/μl EcoR I Adaptor 3.5 μl,350 U/μl T4 DNA Ligase 1 μl,10 mm Ratp 1 μl,全量為10 μl.輕輕混勻,8 ℃過夜反應(yīng),70 ℃保溫30～45 min,室溫放置5 min.

　　1.2.5 限制酶XhoI酶切反應(yīng) 向Adaptor Ligation溶液中加入:10× H buffer 5 μl,50 U/μl Xho I 3 μl,輕輕混勻,37 ℃反應(yīng)3 h.

　　1.2.6 使用Spin Column除去短鏈cDNA及文庫(kù)構(gòu)建 單鏈(single strand,ss)cDNA 擴(kuò)增后合成雙鏈(double strand,ds)cDNA,dscDNA經(jīng)XhoⅠ酶切及柱層析洗脫,收集0.5～5 kb 之間的組分,在T4DNA 連接酶作用下,與pGADT7去磷酸化臂于16 ℃水浴中過夜連接,隨后包裝蛋白包裝載體。

　　1.2.7 文庫(kù)滴定、重組率測(cè)定和擴(kuò)增 按照構(gòu)建的cDNA 文庫(kù)滴度文庫(kù)滴定公式[2]:原始文庫(kù)滴度=克隆斑總數(shù)×稀釋倍數(shù)×包裝體積,重組率測(cè)定采用藍(lán)白斑篩選方法,即向含有酵母菌和E.coli.XL1Blue 混合液的上層瓊脂中分別加入50 μl 100 mmol/L的IPTG 和X2Gal,于90 mm 平板上鋪板,置37 ℃孵育過夜,分別計(jì)算藍(lán)色斑和無(wú)色斑數(shù),重組率=無(wú)色噬菌斑數(shù)/(無(wú)色噬菌斑數(shù)+藍(lán)色噬菌斑數(shù)),隨后進(jìn)行文庫(kù)的擴(kuò)增。

　　1.2.8 cDNA文庫(kù)質(zhì)量鑒定 取擴(kuò)增后的cDNA 文庫(kù)鋪板,隨機(jī)挑取16個(gè)克隆斑行PCR 擴(kuò)增,以載體克隆位點(diǎn)兩端的序列設(shè)計(jì)引物(引物合成公司為大連寶生物工程有限公司):引物1:5'GGAGTACCCATACGACGTACC3'及引物2:5'TATCTACGATTCATCTGCAGC3',反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性1 min,于95 ℃30 s,55 ℃30 s,72 ℃3 min循環(huán)30周,后于72 ℃延伸10 min.1% Agarose Ge電泳,檢測(cè)Insert DNA的片段長(zhǎng)度。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 總RNA的制備和mRNA的分離純化

　　提取的總RNA于紫外分光光度儀檢測(cè)吸光度OD=A260/A280=1.92,于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳可見28 S、18 S、5 S 3條清晰帶,28 S∶18 S 約為2∶1(圖1),純化后的mRNA于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳顯示為為0.5～5 kb 的片狀條帶,說明所提取的mRNA質(zhì)量較純。

　　2.2 cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建

　　poly(A)+ RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增后,于11 g/L瓊脂糖凝膠上電泳,dscDNA在0.4～5 kb之間形成一片狀條帶,經(jīng)酶切及柱層析洗脫后,收集長(zhǎng)度在0.5 kb 以上的組分,經(jīng)乙醇沉淀濃縮后,溶于7 μl 去離子水中,取3 μl 于11 g/L瓊脂糖凝膠上電泳,顯示為長(zhǎng)度在0.5～4 kb 的一片狀條帶(圖2),即可與載體pGADT7連接。構(gòu)建的文庫(kù)經(jīng)效價(jià)測(cè)定,文庫(kù)的克隆數(shù)為4.00 ×106 pfu/ml,以藍(lán)白斑篩選檢測(cè)重組率> 95 %,文庫(kù)經(jīng)擴(kuò)增后,滴度達(dá)9.50×109pfu/ml.

　　2.3 cDNA 文庫(kù)的質(zhì)量鑒定

　　隨機(jī)挑取16個(gè)克隆斑,以載體克隆位點(diǎn)兩端引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增插入的cDNA 片段,以瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,結(jié)果顯示,cDNA 插入片段長(zhǎng)度均在500～2 000 bp(圖3)。

　　3 討論

　　目前,構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的方法主要有以下幾種:Oligocapping法[3],CAP ture法[4],SMART法[56],CapSelect法[7],Capjumping法[8]以及Captrapper法[9]等。 所有的這些方法都著眼于真核生物mRNA 5'端的帽子結(jié)構(gòu),但又各有其獨(dú)到之處.總的說來,cDNA文庫(kù)構(gòu)建大致經(jīng)分離總RNA,純化mRNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后與兩端帶有限制性酶切位點(diǎn)的人工接頭相連接,并將其插入到載體中,轉(zhuǎn)染大腸桿菌,得到cDNA文庫(kù)。而酵母菌可替代大腸桿菌作為受體菌克隆真核基因。酵母菌屬真核單細(xì)胞生物,基因組僅為大腸桿菌的4倍,但它卻可以像原核細(xì)胞一樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。因此,酵母菌是遺傳工程中用于表達(dá)真核細(xì)胞基因較理想的受體細(xì)胞[10]。

　　成功地構(gòu)建一個(gè)全長(zhǎng)cDNA 文庫(kù),關(guān)鍵問題是要分離得到高質(zhì)量的mRNA,并且mRNA種類越多,cDNA 文庫(kù)就越完整。導(dǎo)致RNA質(zhì)量不高的原因主要有兩個(gè):一是總RNA有降解,在瓊脂糖凝膠電泳上表現(xiàn)為28 S與18 S條帶模糊,呈彌散狀,5 S條帶出現(xiàn)高濃度。我們所提取的RNA在瓊脂糖凝膠電泳上表現(xiàn)為28 S、18 S、5 S 3條清晰條帶,其中28 S∶18 S 約為2∶1,說明RNA沒有降解。二是RNA的污染,提取的RNA于紫外分光光度計(jì)檢測(cè)A260/A280比值在1.90～2.1時(shí),RNA質(zhì)量較純。A260/A280值低,說明有較多的蛋白質(zhì)污染。這些蛋白質(zhì)可嚴(yán)重降低逆轉(zhuǎn)錄酶的催化效率。我們所提取的RNA經(jīng)檢測(cè),A260/A280值為1.92,說明所提取的RNA較純。

　　在cDNA 文庫(kù)構(gòu)建完成之后,一般需對(duì)載體中插入片段的大小進(jìn)行檢測(cè)。本研究得到了插入子片段,成功地進(jìn)行了cDNA 文庫(kù)的鑒定。插入片段長(zhǎng)度在500～2 000 bp之間,且長(zhǎng)度并不均一,說明我們所構(gòu)建的文庫(kù)具有一定復(fù)雜性。

　　我們運(yùn)用此方法構(gòu)建了高效的富集全長(zhǎng)的人正常胃黏膜細(xì)胞全長(zhǎng)cDNA文庫(kù),經(jīng)滴度測(cè)定、重組率、PCR 鑒定均符合cDNA 文庫(kù)的質(zhì)量要求,可以對(duì)其進(jìn)行隨機(jī)挑選克隆測(cè)序分析,并可在以后的工作中利用酵母雙雜交方法尋找引發(fā)胃疾病的相關(guān)基因。

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