腎素-血管緊張素系統(tǒng)基因多態(tài)性與冠心病合并慢性心力衰竭的關(guān)系

　　作者：牛云茜,羅禮云,彭健,梅嘯,彭澍,龔五　　作者單位：1. 中山大學附屬第五醫(yī)院心內(nèi)二科; 2. 珠海市第二人民醫(yī)院心內(nèi)科;3. 暨南大學附屬第三醫(yī)院心內(nèi)科; 4. 暨南大學附屬第三醫(yī)院分子生物實驗中心， 廣東 珠海 　　

　　慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是嚴重危害人類健康的常見病，其病因迄今尚未闡明。CHF與腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)基因多態(tài)性間關(guān)系的研究已成為其病因?qū)W研究的一個熱點[1]，人們?nèi)找骊P(guān)注的因人而異的CHF個體化治療策略亦有賴于CHF遺傳病因?qū)W研究的不斷深入與擴展[2]。但對于RAS基因多態(tài)性與CHF發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，目前國內(nèi)外的研究僅處于初步階段，且研究結(jié)果并不一致，尤其是對雙位點聯(lián)合研究的觀察較少[1]。RAS在維持體內(nèi)水電解質(zhì)平衡、調(diào)節(jié)血管張力以及CHF的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)和血管緊張素原(angiotensinogen，AGT)是RAS中的兩個關(guān)鍵成分。本研究通過檢測ACE和AGT基因多態(tài)性在中國南方部分漢族人群冠心病患者中的分布，以探討兩基因多態(tài)性在冠心病患者發(fā)生CHF中的作用和意義。
　　1 材料和方法
　　1.1 研究對象

　　冠心病病人共215人，均來自2004年4月至2006年12月在本院及珠海市內(nèi)幾家大型醫(yī)院心內(nèi)科住院病員，其籍貫為中國廣東、廣西、湖南、云南、福建等省市。所有患者均經(jīng)冠狀動脈造影檢查，冠心病的診斷標準：左冠狀動脈主干、左前降支、左回旋支及右冠狀動脈中至少1支血管狹窄≥50%。病例組為冠心病合并慢性心力衰竭者共105例(合并高血壓病者52例)，CHF診斷參照修改的Framingham標準，心功能NYHA分級Ⅱ～ Ⅳ級、超聲心動圖檢測左室射血分數(shù)<45%，年齡≥18 歲，CHF病史至少≥3個月，其中男性69例，女性36例，年齡(59 ± 7)歲。對照組為研究對象中沒有合并CHF者，共110 例(合并高血壓病者57例)，其中男性71例，女性39例，年齡(57 ± 9)歲。排除標準：①嚴重肝、腎功能不全;②嚴重的急性感染或代謝紊亂;③急性心力衰竭;④2周內(nèi)未行血運重建的急性心肌梗死者;⑤合并心瓣膜疾病者。本研究對象間無血緣關(guān)系，均為中國南方漢族成人，所有研究對象均知情同意。
　　1.2 檢測指標
　　調(diào)查所有研究對象的吸煙、高血壓、糖尿病及高血脂史，測量身高、體重，檢測空腹血糖及血脂、血紅蛋白、肝功能、腎功能。
　　1.3 人基因組DNA的提取
　　抽取外周靜脈血5 mL，20 g/L EDTA抗凝，低滲法分離白細胞，經(jīng)細胞裂解液及蛋白酶K消化，酚/氯仿/異戊醇方法提取基因組DNA，無水乙醇沉淀，保存于TE溶液中。
　　1.4 ACE基因I/D多態(tài)性檢測
　　引物序列：P1，5′-CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3′;P2，5′-GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T-3′。聚合酶鏈反應(yīng)體系總體積共20 μL，其中模板DNA 1 μL，10×緩沖液 2 μL，0.5 U/μL Pfu DNA聚合酶1 μL，10 μmmol /L的 P1及P2各1 μL, 2 mmol/L dNTP 2 μL。在PE-2400全自動基因擴增儀上擴增，94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min ，72 ℃延伸1.5 min ，循環(huán)30次，72 ℃終末延伸5 min。反應(yīng)產(chǎn)物在含有溴化乙錠的10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，電壓100 V，30 min，紫外燈下觀察基因分型[3]。
　　1.5 AGT基因M235T多態(tài)性檢測
　　引物序列：P1， 5′-CAG GGT GCT GTC CAC ACT GGA CCC C-3′, P2， 5′-CCG TTT GTG CAG GGC CTG GCT CTCT-3′。聚合酶鏈反應(yīng)體系總體積共30 μL，其中模板DNA1.5 μL，10×緩沖液3 μL，1 U/μL Pfu DNA聚合酶1 μL， 12 μmmol/L 的P1及P2各1 μL，2 mmol/L dNTP 3 μL。在PE-2400全自動基因擴增儀上擴增，94 ℃變性1 min，65 ℃退火1 min ，72 ℃延伸1.5 min ，循環(huán)30次，72 ℃終末延伸5 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察。酶切反應(yīng)體系總體積共20 μL，其中PCR產(chǎn)物10 μL，Tth111 I內(nèi)切酶(Fermentas公司)1 μL，10×緩沖液 2 μL，無菌去離子水7 μL，混勻后置37 ℃水浴箱中水浴16 h。酶切反應(yīng)產(chǎn)物含有溴化乙錠的30 g/L瓊脂糖凝膠上電泳[4]。
　　1.6 統(tǒng)計分析

　　應(yīng)用SPSS15.0 for Windows 進行統(tǒng)計分析。組間均數(shù)比較用t檢驗，基因型分布及等位基因頻率比較用χ2檢驗?；蛐图暗任换蛳鄬ξｋU度以優(yōu)勢比(OR)及其95%置信區(qū)間(CI)表示，應(yīng)用二項Logistic回歸分析冠心病患者發(fā)生CHF的易患因素。P < 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　2 結(jié)果

　　2.1 兩組一般臨床資料的比較

　　兩組在年齡、性別構(gòu)成、病程、既往曾發(fā)生心肌梗死的例次、吸煙率、體重指數(shù)、收縮壓、舒張壓、血紅蛋白(HGB)、空腹血糖(BS)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)等方面無統(tǒng)計學差異。病例組甘油三酯(TG)低于對照組，血肌酐(Cr)高于對照組(P < 0.05)。
　　2.2 Hardy-Weinberg平衡檢測
　　本組資料中，對照組ACE及AGT基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2分別為3.750和0.078，P > 0.05)，表明該群體為遺傳平衡群體，本研究資料具有群體代表性。
　　2.3 兩組基因型頻率及等位基因頻率的比較
　　2.3.1 病例組和對照組ACE基因I/D多態(tài)性分布
　　病例組DD基因型頻率明顯高于對照組，與非DD型相比，DD型者發(fā)生CHF的OR為2.721(95%CI:1.517 ～ 4.878)。同時，D等位基因頻率也較對照組高(表1)。
　　2.3.2 病例組和對照組AGT基因M235T多態(tài)性分布 兩組TT基因型頻率無統(tǒng)計學差異。同時，T等位基因頻率分布亦無統(tǒng)計學差異(表2)。
　　2.4 ACE基因I/D及AGT基因M235T多態(tài)性的聯(lián)合分析

　　病例組及對照組中同時具有ACE基因DD型及AGT基因TT型者的頻率分別為27.6%及14.5%，前者高于后者(表3)。
　　2.5 非條件Logistic回歸分析冠心病患者CHF的易患因素
　　以ACE基因型、AGT基因型、性別、年齡、病程、吸煙史、收縮壓及舒張壓、TC、TG、LDL-C、HGB、空腹血糖為自變量，以冠心病患者是否發(fā)生CHF為因變量，并定義ACE基因型、AGT基因型、性別和吸煙史為分類變量，用Forward:Ward法建立非條件Logistic回歸模型進行多因素分析，結(jié)果表明，ACE基因型及TG與冠心病患者發(fā)生CHF相關(guān)，而AGT基因型、病程、血壓等其他因素被剔除(表4)。以II型為參照，DD型發(fā)病的OR為5.215。聯(lián)合ACE基因型及AGT基因型建立回歸模型，結(jié)果ACE基因型及AGT基因型、TC 、HGB被引入方程，其他因素被剔除(表5)。表明DD+TT、DD+MT、DI+TT基因型、HGB、TG參與總體冠心病患者CHF發(fā)生的概率。以II+MM型為參照，DD+TT基因型發(fā)病的OR為5.039。
　　3 討 論
　　不同的冠心病患者在臨床表型及預后等方面存在著顯著的差別，部分患者發(fā)生CHF的時間明顯較其他患者早，心功能惡化的程度亦較嚴重。除已知的危險與干預因素影響外，個體基因的不同與變異可能在CHF的發(fā)生與發(fā)展及治療轉(zhuǎn)歸等方面起不容忽視的重要作用[1，2]。
　　3.1 ACE基因I/D多態(tài)性與CHF

　　近年來ACE基因I/D多態(tài)性與心血管疾病遺傳易感性及臨床表現(xiàn)的關(guān)系已受到國內(nèi)外學者的關(guān)注。研究證實，ACE基因多態(tài)性與體內(nèi)ACE水平及左室重構(gòu)、左室功能有關(guān)，DD基因型的血清ACE水平高[5，6]。karaali等[7]則發(fā)現(xiàn)心肌梗死后左室肥厚 ( left ventricular hypertrophy ,LVH)與ACE基因多態(tài)性相關(guān)，DD基因型增加心梗后LVH的風險。俄羅斯學者也曾對發(fā)生過心肌梗死的冠心病患者進行研究，結(jié)果表明DD-ACE基因型及D等位基因會增加冠心病患者CHF的發(fā)生幾率，而且該基因型可作為心功能惡化程度的一個標志[8]。但也有研究發(fā)現(xiàn)DD-ACE基因型并不增加冠心病患者發(fā)生CHF的風險[9]。本研究以215例冠心病患者作為研究對象，其中合并CHF者的DD基因型及D等位基因頻率明顯高于心功能正常者，提示ACE基因I/D多態(tài)性與中國南方部分漢族人群冠心病患者發(fā)生CHF有關(guān)，DD型ACE基因可能是該地區(qū)冠心病患者CHF發(fā)病的遺傳危險因素。關(guān)于ACE基因多態(tài)性、ACE與CHF的發(fā)病機理仍尚待闡明，多數(shù)學者認為ACE基因可能是通過影響了血清和內(nèi)皮細胞中的ACE水平而影響了外周或局部循環(huán)中的血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)和緩激肽濃度。外周AngⅡ具有強大的縮血管作用，且能刺激醛固酮的釋放和增強交感神經(jīng)釋放去甲腎上腺素，從而使心室的前、后負荷均明顯增加。同時AngⅡ可在局部組織生成并獨立發(fā)揮調(diào)控作用。實驗研究表明，肥大心肌中AGT及ACE的表達，以及AngⅡ的含量均明顯增加[10]。AngⅡ可通過其受體刺激心肌細胞肥大和成纖維細胞增殖并使兩者的表型改變，從而終導致心肌重構(gòu)和心功能惡化。
　　3.2 AGT基因M235T多態(tài)性與CHF

　　RAS中的另一關(guān)鍵成分AGT基因M235T多態(tài)性與較高的血漿血管緊張素原水平、高血壓及左室肥厚相關(guān)[11]。關(guān)于該基因多態(tài)性與CHF的關(guān)聯(lián)性研究國內(nèi)外開展較少，新的一項研究發(fā)現(xiàn)，攜帶TT型AGT基因的高血壓患者發(fā)生CHF的危險性增加，且發(fā)病年齡較其他基因型者早約十年[12]。但其與冠心病患者發(fā)生CHF的關(guān)聯(lián)性資料尚缺乏研究，我們初次探討了AGT基因多態(tài)性在冠心病患者發(fā)生CHF中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AGT M235T 基因型的分布在冠心病合并CHF組及對照者間無明顯差異，提示該人群的AGT M235T 基因多態(tài)性與冠心病患者發(fā)生CHF似無關(guān)。其原因可能是由于心血管疾病在遺傳方面的特點是受多個微效基因及基因與基因、基因與環(huán)境之間諸多相互作用的影響，而單一基因?qū)嶋y發(fā)揮決定性臨床表型作用。
　　3.3 ACE I/D及AGT M235T雙基因多態(tài)性與CHF

　　CHF是多基因疾病,僅分析單個基因獲得的信息量較少,結(jié)果不甚可靠。宜選擇多個候選基因客觀地從不同側(cè)面分析，既需探討某一基因多態(tài)性的作用，更需要對不同候選基因之間的相互作用進行分析。本研究聯(lián)合分析了ACE I/D和AGT M235T 基因多態(tài)性與冠心病患者發(fā)生CHF的關(guān)系，結(jié)果表明冠心病合并CHF組ACE-DD + AGT-TT基因型頻率明顯高于對照組，進一步應(yīng)用二項Logistic回歸分析CHF的易患因素發(fā)現(xiàn)，ACE和AGT基因在冠心病患者CHF的發(fā)生中具有協(xié)同作用，以II + MM型為參照，DD+TT基因型發(fā)病的OR為5.039，高于ACE-DD型單基因發(fā)生CHF的OR(2.721)，DD型基因的冠心病患者若同時攜帶有TT基因，發(fā)生CHF的幾率明顯增高。
　　本研究進一步佐證了我們之前的觀點：腎素-血管緊張素系統(tǒng)基因多態(tài)性與CHF的發(fā)生及病情嚴重程度存在關(guān)聯(lián)，DD-ACE基因型是CHF發(fā)生的危險因素，且攜帶DD基因型的CHF患者病情更加嚴重[13]。