DNA片段長度分析檢測急性髓性白血病CEBPA 基因突變

　　作者：阮國瑞,牛繼紅,李玲娣,張瑤,李金蘭　　作者單位：100044　北京大學(xué)人民醫(yī)院血液病研究所

　　【摘要】目的建立檢測急性髓性白血病(AML)髓系轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強子結(jié)合蛋白-A(CEBPA)基因突變的快速篩查方法。方法　采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增產(chǎn)物片段長度分析及序列分析方法檢測107例初治AML患者CEBPA基因全部編碼區(qū)突變情況。來自同種基因移植供者的38例正常人作為對照。結(jié)果　同時用測序及片段長度分析的方法檢測了107例AML患者及38例正常人CEBPA突變的情況，在排除了已知的多態(tài)位點以后，在107例AML患者中篩查出22例患者存在CEBPA突變，其中4例患者存在2種CEBPA突變，18例患者存在1種CEBPA突變，而在38例正常人中沒有發(fā)現(xiàn)CEBPA突變。與測序結(jié)果比較，片段長度分析檢測CEBPA突變是敏感和有效的。結(jié)論　片段長度分析是一種快速、敏感地篩查CEBPA基因突變的方法，適合常規(guī)的AML診斷。
　　【關(guān)鍵詞】 白血病，粒細胞，急性;　CCAAT增強子結(jié)合蛋白α;　聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);　序列分析，DNA

　　【Abstract】　ob[x]jective　To establish a rapid screening method for CEBPA(CCAAT-Enhancer Binding Protein-alpha，CEBPA)mutations.Methods　We detected mutations throughout the entire coding region of the CEBPA gene in 107 untreated AML patients using polymerase chain reaction (PCR) followed by sequence analysis and fragment length analysis.Thirty-eight normal donors from the allogeneic stem cell transplantation were served as control.Results　We evaluated the approach by analysing 107 AML patient and 38 normal samples by both fragment length analysis and nucleotide sequencing.Twenty-two cases with CEBPA mutation were found in 107 AML patients after excluding all known CEBPA polymorphisms.Of 4 CEBPA mutated patients had two mutations and 18 patients had a single mutation.No mutation was found in 38 normal samples.CEBPA mutation detection by fragment length analysis is sensitive and efficient when compared to nucleotide sequencing.Conclusions　We established a fast and sensitive CEBPA mutation screening method for routine AML diagnostics.

　　【Key words】　Leukemia，myelocytic，acute;　CCAAT-enhancer-binding protein-alpha;　Polymerase chain reaction;　Sequence analysis，
　　DNA急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)是由髓系造血干/祖細胞發(fā)生累積性獲得性基因改變導(dǎo)致正常的細胞增殖、分化和凋亡而發(fā)生改變的一種惡性疾病，是成人急性白血病的主要類型，分類復(fù)雜，發(fā)病機制至今尚不明確，在臨床及遺傳學(xué)上均具有顯著異質(zhì)性。成人AML患者中大約55%可鑒定出細胞遺傳學(xué)異常，大約45%的AML患者表現(xiàn)為正常核型[1-2]。新公布的WHO白血病分類標(biāo)準(zhǔn)[3]中，強調(diào)在初診評估時就應(yīng)對骨髓樣本進行全面的細胞遺傳學(xué)分析，特別是NPM1、CEBPA和FLT3突變，在新修訂的分類標(biāo)準(zhǔn)中已成為AML重要的預(yù)后參考指標(biāo)，可能成為新的治療靶點。NPM1和FLT3突變已成為常規(guī)診斷項目，而CEBPA(CCAAT增強子結(jié)合蛋白A)突變類型多樣，且突變分布在CEBPA基因的全部編碼區(qū)、序列片段長、GC含量高，盡管核苷酸測序是檢測基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)，但針對CEBPA突變的測序耗時長、難度大、費用高，需要開發(fā)新的篩查方法[4]。我們在對107例AML患者及38例正常人測序的基礎(chǔ)上，建立了針對CEBPA基因全部編碼區(qū)的一種快速、簡便、敏感的篩查方法，介紹如下。
　　對象與方法
　　1. 研究對象：AML患者107 例，選自2007年1月至2010年1月在北京大學(xué)人民醫(yī)院就診的初診病例，均為染色體核型正常者，其中男61例，女46例，年齡15～86歲，中位年齡42歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)世界衛(wèi)生組織新的分型標(biāo)準(zhǔn)[3]。正常骨髓移植供者38例作為對照組。
　　2. 待測樣品制備：107份患者骨髓標(biāo)本及38例正常人骨髓或外周血標(biāo)本，參照DNAzol 試劑盒(Invitrogen公司)說明書在無菌條件下提取基因組DNA，方法為：用Na2EDTA抗凝，用淋巴細胞分層液(相對密度1.077 g/L，上海華精高科技有限公司)分離出單個核細胞，將分離出的單個核細胞用生理鹽水洗滌2次后，加入600 μl DNAzol試劑，參照試劑盒說明書提取DNA，在ND-1000分光光度計上檢測濃度 (NanoDrop 科技有限責(zé)任公司)，所有用于PCR的DNA樣本的A260∶A280比值均>1.8。
　　3. PCR 擴增CEBPA基因：實驗中擴增CEBPA基因全部編碼區(qū)所用的引物序列參照文獻[4]合成，4對熒光標(biāo)記的引物序列見表1，同時合成不攜帶標(biāo)記基團的4對引物，引物序列同表1。以待測者的DNA為模板，分別用以上4對熒光標(biāo)記的引物或不攜帶標(biāo)記基團的4對引物進行擴增，分別可以得到4種擴增產(chǎn)物，覆蓋CEBPA基因全部編碼區(qū)，其中利用不含熒光標(biāo)記的引物擴增的產(chǎn)物用于測序分析，利用含熒光標(biāo)記的引物擴增的產(chǎn)物用于片段長度分析。
　　PCR 混合體系中包括2×Universal PCR Mastermix (天根生物技術(shù)有限公司，北京),400 nmol/L引物和150～500 ng的DNA。擴增1～3片段時，PCR 步驟如下：95 ℃變性5 min;接下來是 95 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，共35個循環(huán);后 72 ℃延長 7 min。擴增4片段時，PCR 步驟如下：95 ℃變性5 min;接下來是 95 ℃ 30 s,65 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，共35個循環(huán);后 72 ℃延長7 min。
　　4. 序列分析：PCR擴增產(chǎn)物1～4經(jīng)純化后，由上海基康有限公司分別利用下游引物在ABI3700 DNA分析儀上完成測序工作。測序結(jié)果與美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)基因庫序列(NM_004364.2)進行比對。
　　5. 片段長度分析：含熒光標(biāo)記的引物擴增的產(chǎn)物1～4用于片段長度分析。在ABI PRISM? 3730 DNA 分析儀上，使用GeneScan程序電泳，電泳數(shù)據(jù)經(jīng)Genemapper 軟件( 3.7版)處理后得到檢測片段大小，其中產(chǎn)物1、2或產(chǎn)物3、4可同時進行片段長度分析，見表1。　　表1　檢測CEBPA基因突變的引物
　　結(jié)　　果
　　1. 測序與片段長度分析篩查CEBPA基因突變結(jié)果的比較：在107例AML患者DNA樣本中，測序檢查發(fā)現(xiàn)CEBPA基因突變22例，其中4例患者存在2種CEBPA突變，18例患者存在1種CEBPA突變，共26個突變位點，均為插入或缺失突變，且均可被片段長度分析的方法檢出，而在38例正常人中除多態(tài)位點外均未檢出CEBPA基因突變。如圖1所示，圖1A為1位正常人CEBPA基因全部編碼區(qū)的4個擴增產(chǎn)物片段長度分析的結(jié)果;圖1B、1C分別為編號6、編號13患者的CEBPA基因4個擴增產(chǎn)物片段長度分析的結(jié)果，前者擴增產(chǎn)物1、產(chǎn)物3分別存在1個堿基的插入及缺失，后者擴增產(chǎn)物1、產(chǎn)物4分別存在1個及41個堿基的插入。圖2示AML患者CEBPA基因突變序列分析的結(jié)果，圖2A、2B分別為編號6患者擴增產(chǎn)物1、產(chǎn)物3的測序結(jié)果。圖2C、2D分別為編號13患者擴增產(chǎn)物1、產(chǎn)物4的測序結(jié)果。
　　2. 測序與片段長度分析CEBPA基因多態(tài)位點的結(jié)果比較：在107例AML患者DNA樣本中，測序檢查發(fā)現(xiàn)33例存在CEBPA基因(擴增產(chǎn)物3)第584～589位多態(tài)性位點(ACCCGC重復(fù)序列，圖3A)，在38例正常人DNA樣本中，發(fā)現(xiàn)8例存在該多態(tài)性位點。在所測的所有樣本擴增產(chǎn)物3的測序結(jié)果中，沒有發(fā)現(xiàn)除了該6個ACCCGC堿基重復(fù)序列以外的6個堿基的插入或缺失。在片段長度分析擴增產(chǎn)物3的結(jié)果中，篩查出的6個堿基的插入樣本測序結(jié)果均證實為該多態(tài)位點(圖3B)。
　　3. 測序與片段長度分析CEBPA基因突變陽性患者結(jié)果的比較(表2)：經(jīng)測序與片段長度分析22例CEBPA基因突變陽性患者結(jié)果的比較，測序檢查的結(jié)果可與NCBI基因庫序列 NM_004364.2比對，結(jié)果顯示為沒有發(fā)現(xiàn)異常，或在確定的位點處顯示為插入、缺失及置換突變等;片段長度分析結(jié)果顯示為與野生型擴增片段大小相比，沒有發(fā)現(xiàn)片段大小異常，或與野生型擴增片段大小相比，該片段插入、缺失1個堿基及1個堿基以上的片段大小的改變。測序檢查發(fā)現(xiàn)的CEBPA基因突變22例，共26種CEBPA基因突變位點，均表現(xiàn)為插入或缺失突變，且均可被片段長度分析的方法檢出。其中在7例患者擴增產(chǎn)物3中發(fā)現(xiàn)存在插入6個堿基的擴增產(chǎn)物，測序結(jié)果顯示為584～589 位ACCCGC重復(fù)序列多態(tài)位點。
　　討　　論
　　由基因突變導(dǎo)致的細胞增殖、分化和細胞凋亡表2　測序與片段長度分析22例CEBPA基因突變陽性患者結(jié)果的比較

　　途徑的改變是AML的發(fā)病基礎(chǔ)。其中CEBPA在造血系統(tǒng)中只表達于髓系細胞，是髓系祖細胞增殖與分化過程中一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，具有誘導(dǎo)粒系的分化和抑制增生的作用。CEBPA突變的檢測在AML患者的診斷、分層、預(yù)后評估及治療方案選擇中具有重要意義，但針對此突變的篩查有一定難度，原因是：(1)CEBPA基因編碼358個氨基酸[5]，無內(nèi)含子，序列片段長，GC含量高，突變分布在該基因的全部編碼區(qū)。(2)突變類型多樣，可能是一種或多種突變同時出現(xiàn)。盡管核苷酸測序是檢測基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)，但針對CEBPA基因全部編碼區(qū)的測序需分4個片段，由于GC含量高，測序難度大、耗時長、費用高，且一次測序難以保證在一定的時間內(nèi)每個樣本都能得到測序的滿意結(jié)果，不適合大規(guī)模的或常規(guī)分析。
　　我們在對107例正常核型AML患者該基因全部編碼區(qū)測序檢查發(fā)現(xiàn)22例突變的基礎(chǔ)上，初步建立了PCR擴增產(chǎn)物片段長度分析的方法，可敏感準(zhǔn)確地檢測出1個堿基的缺失或插入突變。在排除已知的多態(tài)位點以后，測序結(jié)果與片段長度分析的結(jié)果一致，在107例AML患者中，兩種方法均可發(fā)現(xiàn)22例CEBPA基因突變，共26種突變位點。此外，CEBPA基因第584～589位6個堿基的重復(fù)序列已報道為多態(tài)性位點[6-7]，我們片段長度分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)107例AML患者中33例、38例正常人中8例，在擴增產(chǎn)物3中存在6個堿基的插入，測序結(jié)果均證實為該多態(tài)位點，在所測的所有樣本擴增產(chǎn)物3的測序結(jié)果中，沒有發(fā)現(xiàn)除了該位點以外的6個堿基的插入或缺失。
　　PCR擴增產(chǎn)物片段長度分析是一種快速、簡便、準(zhǔn)確地篩查CEBPA基因突變的方法，重復(fù)性好、成本低，可替代測序用于CEBPA基因突變的篩查。但應(yīng)注意在判定CEBPA基因突變時，應(yīng)排除已知的多態(tài)性位點，特別是檢出率較高的第584～589位多態(tài)性位點，從表2的結(jié)果分析，該多態(tài)位點與其他片段CEBPA突變并存的百分率為31.8%(7/22)，這些病例可直接報告為突變陽性，而對于單一出現(xiàn)的產(chǎn)物3中6個堿基的插入，不應(yīng)認為是突變，必要時應(yīng)測序驗證。片段長度分析方法的缺點是不能鑒別單堿基置換造成的突變或多態(tài)位點，我們對107例AML患者測序的結(jié)果進行了分析，沒有發(fā)現(xiàn)單堿基置換造成的突變，兩種方法均可發(fā)現(xiàn)26種CEBPA基因突變位點。但Benthaus等[4]總結(jié)了已報道的對CEBPA基因全部編碼區(qū)檢測所發(fā)現(xiàn)的單堿基置換， 在總數(shù)為1295例的患者中，發(fā)現(xiàn)15例存在單堿基置換，其中7 例有另外的影響片段長度的突變，只有8例是單一的單堿基置換造成的突變，估計片段長度分析CEBPA基因突變的假陰性率是0.62%，可鑒定99.38%的CEBPA突變。
　　總之，片段長度分析CEBPA基因突變是一種快速、簡便、敏感的篩查方法，適合于大規(guī)模檢測或常規(guī)AML診斷，可用于臨床上分子分型、個體化診斷和預(yù)后預(yù)測，為患者選擇合適的治療方法提供依據(jù)。
　　(本文圖片見光盤)

　　【參考文獻】
　　[1]　Slovak ML，Kopecky KJ，Cassileth PA，et al.Karyotypic analysis predicts outcome of preremission and postremission therapy in adult acute myeloid leukemia：a Southwest Oncology Group/Eastern Cooperative Oncology Group Study.Blood,2000,96(13)：4075-4083.

　　[2]　Byrd JC， Mrózek K，Dodge RK，et al.Pretreatment cytogenetic abnormalities are predictive of induction success，cumulative incidence of relapse，and overall survival in adult patients with de novo acute myeloid leukemia：results from Cancer and Leukemia Group B (CALGB 8461).Blood,2002,100(13)：4325-4336.

　　[3]　Swerdlow SH，Campo E，Harris NL，et al.WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues.4th ed.International Agency for Research on Cancer(IARC)France，Lyon：2008.

　　[4]　Benthaus T，Schneider F，Mellert G，et al.Rapid and sensitive screening for CEBPA mutations in acute myeloid leukaemia.Br J Haematol,2008,143(2)：230-239.

　　[5]　Trivedi AK，Bararia D，Christopeit M，et al.Proteomic identification of C/EBP-DBD multiprotein complex：JNK1 activates stem cell regulator C/EBPalpha by inhibiting its ubiquitination.Oncogene,2007,26(12)：1789-1801.

　　[6]　Lin LI， Chen CY， Lin DT， et al.Characterization of CEBPA mutations in acute myeloid leukemia：most patients with CEBPA mutations have biallelic mutations and show a distinct immunophenotype of the leukemic cells.Clin Cancer Res,2005,11(4)：1372-1379.

　　[7]　Fuchs O，Provaznikova D，Kocova M，et al.CEBPA polymorphisms and mutations in patients with acute myeloid leukemia，myelodysplastic syndrome，multiple myeloma and non-Hodgkin′s lymphoma.Blood Cells Mol Dis,2008,40(3)：401-405.