不同停搏液對(duì)體外循環(huán)后未成熟心臟內(nèi)皮激活和炎性因子表達(dá)的影響

　　目前對(duì)嬰幼兒心臟手術(shù)中佳停搏液的理解仍是有限的,對(duì)陰.斷時(shí)間較長(zhǎng)的未成熟心臟采用何種停搏液能達(dá)到更好的保護(hù)效果也無(wú)定論.組氨酸一色氨酸-酮戊二酸(HTK)液有單次灌注、作用時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn),但其主要成分組氨酸對(duì)冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮的保護(hù)尚有爭(zhēng)議,含血停搏液的高鉀和反復(fù)多次灌注也是對(duì)冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮保護(hù)不利的因素,內(nèi)皮激活與炎性反應(yīng)關(guān)系密切.本研究旨在觀察體外循環(huán)(cpB)后冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮型一氧化氮合酶(egos)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、心肌組織誘生型一氧化氮合酶(il\1o})及早期炎性細(xì)胞因子的表達(dá),探討兩種停搏液對(duì)長(zhǎng)時(shí)間停跳未成熟心臟保護(hù)作用的差異.
　　材料與方法 　　
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):2周齡清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)用乳豬14頭(購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院),雌雄不限,體質(zhì)量4.4一6.8kg,隨機(jī)分為HTK液組(H組,n=?)和含血停搏液組(B組,n=7).兩組均建立常規(guī)CPB,阻斷主動(dòng)脈后心肌保護(hù)方法:H組單次灌注40ml/kgHTK液(KoehlerChemi公司,德國(guó)),B組I}}I斷灌注含血停搏液(fit.Thomas液和經(jīng)氧合器抽出的血液按I:1混合).本實(shí)驗(yàn)方一案經(jīng)阜外醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查通過(guò).
　　2.實(shí)驗(yàn)方法:所有乳豬肌肉注射咪達(dá)U}侖(0.5mg/kg),氯胺酮(10mg/kg)、靜脈注射芬太尼、咪達(dá)哩侖(0.2ml/kg),維庫(kù)澳錢(qián)(0.4mg/kg)后氣管插管,機(jī)械通氣(Sal-inaHD'I02,德國(guó)),潮氣量10ml/kg,It乎吸頻率26一28次/111117,靜吸復(fù)合維持全麻右頸動(dòng)脈、頸內(nèi)靜脈分另!!置管,多功能監(jiān)護(hù)儀(Philips公司,德國(guó))監(jiān)測(cè)心電圖、動(dòng)脈血壓、中心靜脈壓、體溫經(jīng)正中開(kāi)胸,全身肝素化后行升主動(dòng)脈插管(8Fr導(dǎo)管)、下腔靜脈插管(1乙18hr導(dǎo)管)體外循環(huán)采用人工心肺機(jī)和兒童膜肺(TerumobabyRX,日本)預(yù)充液含200nll新鮮豬全血和100ml6plc輕乙基淀粉,;ACT>480s,以100-150ml/(kg-min)流量開(kāi)始轉(zhuǎn)流,維持平均動(dòng)脈壓0-70rnmHg(]mmHg二0.133kPa),混合靜I泳血氧飽和度65%以上鼻咽溫降至300C,阻斷主動(dòng)脈,經(jīng)主動(dòng)脈根部灌注4℃停搏液,HTK液灌注壓力起始為80100mmHg,維持為40一60mmHg,5一7min灌完;含血停搏液首量為20ml/kg,20一30min復(fù)灌,灌注壓力為100一120nnnHg鼻咽溫降至?5℃,低流量轉(zhuǎn)流.主動(dòng)脈阻斷2h后開(kāi)放,復(fù)溫至360C停機(jī).
　　3.觀察指標(biāo):CPB前、阻斷前、開(kāi)放后、停機(jī)、停機(jī)2h分別采動(dòng)脈血作血?dú)夥治?I}OV;}(:CX,美國(guó)卜停機(jī)2h后,靜注10%氯化鉀5ml使心臟停跳,快速取左冠狀動(dòng)脈血管和左室心肌標(biāo)本,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后放人液氮灌凍存血管和心肌標(biāo)本在冰浴下加人細(xì)胞裂解液(每100mg組織加裂解液1ml)制備組織勻漿,在4℃下4000r/m離心15min,取上清液檢測(cè)血管"EGLe10S的含量和心肌iNOS、腫瘤壞死因子一a(TNF-cx)、白細(xì)胞介素(IL)-1(3,IL-2的含量,采用試劑盒(R&D公司,美國(guó))用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定,使用瑞士產(chǎn)GeniosPlus多功能熒光酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(}1)值萬(wàn)、4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析計(jì)量資料以士’數(shù)土.午差表示,組間比較采用t檢驗(yàn)或Mann-WhitneyU檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料的比較采用X檢驗(yàn),不同時(shí)點(diǎn)變量的比較采用重復(fù)測(cè)量分析.
　　結(jié)果
　　1.兩組乳豬一般情況比較:乳豬體質(zhì)量H組為(5.3士0.6)kg,B組為(5.6士0.9)kg,雌/雄比}I組為3/4,B組為4/3,兩組乳豬體質(zhì)量、性別比組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);兩組CPB時(shí)間、降溫時(shí)間、復(fù)溫時(shí)間、低鼻咽溫、開(kāi)放后室顫率、多巴胺和腎上腺素用量組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.O5),但B組異體血用量明顯大于H組(P<0.05)(表1).
　　2.兩組圍術(shù)期心率、平均動(dòng)脈壓、中心靜脈壓、左房壓等血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)和體溫的變化:組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);在主動(dòng)脈開(kāi)放后即刻和開(kāi)放后1h,H組血鈉濃度分別為(130.411.7)和(134.1士2.4)mmol/L,B組血鈉濃度分別為(139.4士1.3)和(140.7士0.9)mmol/L,H組血鈉濃度較B組均明顯降低(P<0.05);兩組動(dòng)脈血pH值、氧分壓、二氧化碳分壓、紅細(xì)胞比容、乳酸、血糖、血氧飽和度(SvO,)的變化組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).
　　3.CPB后冠狀動(dòng)脈血管組織勻漿eNOS,Z'EGF'的含量:心肌組織勻漿iNOS,TNF-a,IL-1p和IL-2的含量,兩組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表2).
　　4冠狀動(dòng)脈血管eNOS,VEGF和心肌組織iNOS,TNF-cx,IL-1},IL-2含量的相關(guān)分析:心肌組織中iNOS與TNF-},IL-1日、IL-2含量呈正相關(guān),Pearson相關(guān)系數(shù)分別為r=0.55(P<0.05),r=0.59(P<0.05)和r=0.60(P<0.05),TNF-a和IL-1}含量也顯著相關(guān)(r=o.85,p<0.O1).
　　

　　討論
　　CPB手術(shù)中心肌的缺血再灌注損傷是炎性因子產(chǎn)生的主要來(lái)源之一,良好的冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮和心肌保護(hù)可以降低心肌內(nèi)炎性反應(yīng)程度.缺血損傷會(huì)引起eNOS下調(diào),再灌注期冠狀動(dòng)脈血流減少,eNOS上調(diào)是保護(hù)冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能的重要調(diào)節(jié)因素「z-,,可以改善低氧導(dǎo)致的小動(dòng)脈收縮、抑制中性粒細(xì)胞的粘附和滲出;VEGF在促進(jìn)缺血心肌血管新生和側(cè)枝循環(huán)形成、調(diào)節(jié)血管張力和通透性、改善冠狀動(dòng)脈血流方面起重要作用·a-s},因此,在CPB術(shù)后保持冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮eNOS和VEGF的正常表達(dá),對(duì)改善微血管舒縮狀態(tài)、降低血流阻力、減輕心肌缺血再灌注損傷具有重要意義.在CPB后肺損傷中,eNOS對(duì)肺臟有保護(hù)作用,而iNOS過(guò)度表達(dá)具有肺損傷作用.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與含血停搏液比較,HTK液能保持eNOS,VEGF在冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮的表達(dá),不增加心肌組織i10S的表達(dá),這可能與未成熟心肌的代謝特點(diǎn)和HTK液的優(yōu)良特性有關(guān).與成熟心肌比較,未成熟心肌在缺血期間能產(chǎn)生更多的丙氨酸、唬拍酸和蘋(píng)果酸根,無(wú)氧代謝能力更強(qiáng),并含有更多的自由氨基酸可供急性低氧時(shí)消耗,因而對(duì)缺血有更好的耐受Hiramatsu等f(wàn)i的研究證實(shí)未成熟心臟在低溫缺血再灌注后有更好的內(nèi)皮功能和冠狀動(dòng)脈血流的恢復(fù).同時(shí),HTK液有強(qiáng)大的酸緩沖能力,其含有的酮戊二酸可以補(bǔ)充能量代謝底物,色氨酸可以穩(wěn)定細(xì)胞膜,低鉀含量可減輕對(duì)內(nèi)皮的損害,從而對(duì)心臟提供長(zhǎng)時(shí)間的良好保護(hù)本研究結(jié)果顯示,心肌組織中iNOS與TNF-a,IL-1日,IL-2含量均呈顯著正相關(guān),提示iNOS與心肌內(nèi)早期炎性反應(yīng)密切相關(guān).TNF-.和IL-I(3是早期升高的促炎因子,可通過(guò)激活中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等促進(jìn)氧自由基和其他炎性介質(zhì)的釋放;IL-2是早期升高的抗炎因子.iNOS參與心肌損傷的機(jī)制尚不清楚,可能通過(guò)產(chǎn)生NO及其他含氮自由基發(fā)揮細(xì)胞毒作用和干擾酶的代謝,并可與巨噬細(xì)胞分泌的炎性因子相互作用而加重炎性反應(yīng)二本研究結(jié)果顯示,冠狀動(dòng)脈eNOS和VEGF含量與心肌組織iNOS含量并無(wú)明顯相關(guān)性,可能與iNOS的表達(dá)受多種刺激因素調(diào)控有關(guān),如TNF,IL及其他致炎因子均可刺激iNOS在多種細(xì)胞中表達(dá)is},使其在缺血再灌注損傷和炎性反應(yīng)的病理過(guò)程中都起了重要作用HTI液和含血停搏液對(duì)CPB后心肌組織中iNOS和早期炎性因子表達(dá)的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明兩者在防止未成熟心肌發(fā)生過(guò)度的炎性反應(yīng)卜有相似的作用.
　　目前國(guó)內(nèi)外不同的七科中心對(duì)停搏液的選擇有所不同,HTK液是否適合用于對(duì)長(zhǎng)時(shí)間缺血的未成熟心肌的保護(hù)尚存爭(zhēng)議,按照錢(qián)有輝等[y的研究結(jié)果,HTK液的鉀、鈣等成分一也不符合對(duì)未成熟心肌保護(hù)適宜的濃度,因而其心肌保護(hù)效果有待評(píng)價(jià).含血停搏液的配方可有多種不同的成分和比例,由于1:1含血停搏液是發(fā)達(dá)國(guó)家采用的主流配方,我們將HTK液和1:1含血停搏液進(jìn)行比較,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),無(wú)論在內(nèi)皮激活還是在心肌早期炎性細(xì)胞因子的釋放上,HTK液和l:1含血停搏液差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,兩者在防止心肌內(nèi)炎性損傷上有相似的作用.因此,對(duì)阻斷時(shí)間在2h以?xún)?nèi)的未成熟心臟,HTK液有與含血停搏液相似的保護(hù)作用,可以在嬰幼兒中安全應(yīng)用.HTK液有單次劑量灌注、避免反復(fù)灌注造成未成熟心肌水腫、保持無(wú)血的術(shù)野、不干擾復(fù)雜手術(shù)的操作、減少預(yù)充用血量等優(yōu)點(diǎn),其中減少異體血的輸人對(duì)縮短嬰幼兒心臟手術(shù)后機(jī)械通氣時(shí)間、促進(jìn)患兒康復(fù)有積極的作用.
　　它注意的是,HTK液會(huì)引起不同程度的血鈉下降,應(yīng)積極預(yù)防,避免發(fā)生嚴(yán)重的低鈉血癥.
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