微小RNA-145通過調控上皮細胞間質化抑制肺腺癌起始細胞的發(fā)生

　　腫瘤起始細胞(CICs)理論當前受到廣泛重視,CICs被認為是一小部分具有自我更新、無限增殖、分化等干細胞潛能的細胞群,是腫瘤不斷復發(fā)轉移、難以治愈的根源f>>.現有證據表明,CIC、不但可能來源于惡變的正常干細胞,亦可由已分化的細胞通過上皮一間充質轉化(EMT)"去分化"而重新獲得十細胞樣特性,但其調控機制尚不完全清楚.新近研究表明,微小RNA(miRNA)可通過干預腫瘤細胞自我更新相關信號通路影響EMT,從而調控腫瘤的干細胞特性.我們前期研究結果顯示,miR-145在肺腺癌組織中較正常組織普遍低表達,可抑制肺腺癌細胞株A549中CIC、增殖,是可能的抑癌基因"l,但其具體分子機制尚不清楚.本研究旨在探討miR-145是否可能通過調控EMT來抑制肺腺癌CIC、的發(fā)生.
　　材料與方法 　　
　　1.材料:肺腺癌細胞株A549購于中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫,DMEM/F12培養(yǎng)基購于Hyclone公司.超低載附性24孔培養(yǎng)板購于Corning公司,上皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子((3-FGF)購于BD公司,胰島素購于Sigma公司.
　　miR-145模擬物、阻遏物、miR-145模擬物陰性對照和阻遏物陰性對照購于美國ABI公司.轉染試劑Lipo-fectamine2000購于Invitrogen公司.miRNA提取試劑盒及逆轉錄試劑盒,實時定量聚合酶鏈反應(Real-timePCR)試劑盒、引物miR-145和內參RNU6BMGB探針標記的引物購于美國ABI公司.RNA提取試劑盒Trizol試劑購于Invitrogen公司,PCR逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購于TaKaRa公司.E一鈣勃蛋白(E-cadherin),N一鈣勃蛋白(N-cadherin)、波形蛋自(Vimentin)、角蛋白18(Cytokeratin18),Snail,Slug,階肌動蛋白((3-actin)一抗購于CellSignalingTechnology公司,辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購于北京中杉金橋生物科技有限公司,CD133一抗購于CellSignalingTechnology公司,AlexaFluor594標記的二抗購于Invitrogen公司.
　　2.細胞培養(yǎng)和轉染:采用無血清培養(yǎng)方法富集A549起始細胞微球用于實驗.實驗分組:miR-145模擬物轉染組、阻遏物轉染組、模擬物陰性對照轉染組、阻遏物陰性對照轉染組和只加轉染試劑的無處理組.采用Invitrogen公司Lipofectamine200()試劑盒在超低豁附性24孔培養(yǎng)板進行轉染,每孔加人10pmol模擬物和4閃轉染試劑,使模擬物的終質量濃度為10nmol/L,轉染后Sh換液,每組設3個復孔,實驗重復3次.
　　3.Real-timePCR檢測miRNA的相對定量:轉染48h收獲的細胞樣品,RNA的提取、逆轉錄和PCR反應均嚴格按照ABI公司提供的TaqmanmiRN.
　　4Assay的方法,以RNU6B作為內參進行相對定量,每組設置3個復孔,在ABI7300Real-timePCR不交卜講行檢a}}il-自配的10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)一磷酸鹽緩沖液(PBS)消化細胞,采用間接標記方法檢測各組CD133+細胞比例.流式細胞儀為FACSCalibu(美國BD公司),分析軟件為Flo07.6版本.
　　5.Westernblot蛋白水平檢測:在轉染后72h收獲細胞,以p-actin為內參,分別檢測E-cadherin,N-cadherin,Vimentin,Cytokeratin18,SnailSlug的蛋白表達水平.采用ImageJ軟件對條帶的灰度值進行分析6.統(tǒng)計學方法:應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析.數據以均數士標準差(、士、)表示,多組間均數比較采用單因素方差分析(ANOVA),數據圖表采用Graphic-padPrism5.0軟件制作.
　　結果
　　1.Real-timePCR檢測各組miR-145的表達水平:miR-145模擬物轉染組的miR-145表達是空白對招組班(12.99士0.21)倍(P<0.01),阻遏物轉染組miP}-l}}a7表達水平是空白對照組的(0.2610.01)倍(P<0.01)它表明miR-145模擬物明顯促進了A549趁萬細抱中miR-145的表達,而miR-145阻遏物則明毛卻制miR-145的表達.
　　2.細胞微球形成的定量分析:對9起始細胞微球進行定量分析的結果表明,與對照組北較,過表達miR-145可顯著降低起始細胞微球數_(9.00士2.54)比(22.00士4.48),P<0.05],而抑制miPL-1-15表達微球數顯著增加[(44.00士5.10)比(2}.6715.31),P<0.O1].
　　3.流式細胞術檢測CD133-微球定量分析:miR-145模擬物組中CD133'細胞比例為(25.39士12.37)%,miR-145模擬物陰性對照組(43.70=17.58)%比較明顯降低(P<0.O5);miR-145阻遏廠紐中CD133十細胞比例為(58.89123.54)%,與二iP-_-阻遏物陰性對照組仁(45.60士18.‘58)%〕比救班三二高(P<0.05).
　　4.miR-145對EMT相關蛋白表達P_%--:W表達miR-145可下調EMT相關轉錄因子mail〕一:司充質細胞標志Vimentin,N-cadherin的蛋上哥上皮細胞標志E-cadherin,Cytokeratin18}蛋三.:平:而抑制miR-145則明顯上調Snail,Slug,}imentin,\-cadherin的蛋自水平,下調上皮細胞標志E-cadhrnn,C}tokeratin18的蛋白水平(圖1).
　　討論
　　EMT是指上皮細胞在生理及病理情況下發(fā)生的向間質細胞轉化的形式.其主要表現為上皮細胞失去細胞豁附結構,呈現出間質細胞表型,具有高度的能動性和攻擊性〔5〕現已證實其可能參與調控腫瘤細胞的侵襲、抗凋亡等過程〔并且可能參與誘導已分化的腫瘤細胞向CIC*轉化的過程.
　　

　　miRNA被認為在細胞增殖、凋亡等各個方面都起到重要作用〔6p,新近研究結果顯示,miRN_4可通過調控EMT來調節(jié)腫瘤干細胞特性.miR-200家族可通過抑制Notch通路相關基因B細胞特異的莫洛尼自血病病毒插人位點1基因(Bmil),Jagl,Maml2,Mam13及鋅指E一盒結合同源異形盒一1(ZEB1)影響乳腺癌、前列腺癌細胞株的EMT進而影響其CSCs特性u:;在乳腺癌細胞中,miR}.48表達下調可通過調控特異性核基質結合區(qū)結合蛋白一1(SATBI)基因并與核因子KB(NE-KB基因之間建立正反饋機制,從而促進EMT的發(fā)生i8}.
　　已有研究證實,miR-145在多種腫瘤中是1個抑癌基因,并且在人類干細胞的生長和分化中占據重要作用[9〕.在前期研究中,我們利用miRNA微流體微陣列芯片對大樣本肺癌組織進行miRNA表達譜研究結果顯示:miR-145幾乎在所有患者腫瘤組織中均較癌旁正常組織表達顯著下調.隨后,以人肺腺癌細胞株A549為研究對象,我們發(fā)現miR-145可顯著抑制S期細胞比例從而抑制DNA合成,并且過表達miR-145可顯著抑制A549細胞增殖~4].同時,我們在前期研究中發(fā)現,在A549細胞株中miR-145可通過調控其下游靶基因Oct4來抑制肺腺癌細胞的干細胞樣特性,參與調節(jié)CD133十細胞的比例,而CD133+被認為是肺癌起始細胞的標志.因此提示miR-145可能參與調控肺癌起始細胞的發(fā)生.而新近研究結果顯示:過表達Oct4基因可顯著促進肺腺癌細胞EMT,從而增加CD133表型、微球形成能力等干細胞樣特征.因此,我們認為,通過調控EMT是miR-145抑制肺癌起始細胞發(fā)生的重要機制.
　　為了闡明miR-145調控肺癌起始細胞發(fā)生的可能機制,首先,我們采用上皮生長因子及成纖維細胞生長因子刺激的無血清培養(yǎng)方法富集肺癌起始細胞微球,通過進行miRNA模擬物及阻遏物的轉染來促進和抑制miR-145的表達.運用流式細胞術定量檢測各組CD133的表達比例.過表達miR-145可明顯下調A549起始細胞微球中CD133細胞的比例,而抑制miR-145的表達可明顯增加CD133+細胞的比例.本研究結果顯示,過表達miR-145可下調EMT相關轉錄因子Snail,Slug,間充質細胞標志Vimentin,N-cadherin的蛋白表達水平,上調上皮細胞標志E-cadherin,Cytokeratin18的蛋白水平;而抑制miR-145則明顯增加Snail,Slug,Vimentin,N-cadheri.的蛋自水平,下調上皮細胞標志E-cadherin,Cvtokeratin18的蛋白水平.
　　這些結果表明,miR-145可能通過A549起始細胞內的EMT通路來調控起始細胞的發(fā)生.本實驗結果表明miR-145可抑制肺腺癌起始細胞的發(fā)生,其機制可能與調控EMT通路有關.
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