黃芪多糖通過(guò)激活線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)食管癌EC9706細(xì)胞的凋亡并增加其對(duì)順鉑的敏感性

　　中藥黃+r為豆科植物蒙古黃蔑或莢膜黃蔑干燥塊莖,其中黃蔑多糖為中藥黃茂抗腫瘤的主要有效成分,其可能通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫力,減輕化療的不良反應(yīng)以及增加其他藥物的療效而發(fā)揮抗腫瘤作用,但其與其他藥物聯(lián)合的抗腫瘤機(jī)制尚未完全明確.本研究旨在探討黃茂多糖促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡及與順鉑聯(lián)合的協(xié)同效應(yīng)機(jī)制.
　　材料與方法 　　
　　1.材料:人食管癌EC9706細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存.RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司,窿哩藍(lán)(MTT)、膜聯(lián)蛋白V(AnnexinV),碘化丙錠(PI)購(gòu)自Sigma公司;黃蔑多糖購(gòu)于哈藥集團(tuán)制藥六廠;順鉑購(gòu)于上海旭東制藥廠;B淋巴細(xì)胞/白血病一2(bcl-2),bcl-2相關(guān)X蛋白(bax),核因子一KB(NF-KB),(3一肌動(dòng)蛋白((3-actin)單克隆抗體購(gòu)自SantaCluz,鏈霉菌抗生物素蛋白一過(guò)氧化物酶(SP)試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋公司.
　　2.細(xì)胞培養(yǎng):采用人食管癌細(xì)胞株EC9706,接種于100ml玻璃培養(yǎng)瓶中,在含體積分?jǐn)?shù)10%新生小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng),于370C,5%COZ飽和溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng).細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),每2-3d傳代1次.
　　3.分組與處理:黃蔑多糖組(H組),包括Hl,H2,H3,H4和HS共5個(gè)濃度點(diǎn),其在培養(yǎng)中的終質(zhì)量濃度分別為0.爪1.0,2.0,4.0,8.0剔L;順鉑組(S組),包括Sl,S2,S3,S4和SS共5個(gè)濃度點(diǎn),其在培養(yǎng)中的終質(zhì)量濃度分別為1.25,2.50,5.00,10.00,20.00m郭L;聯(lián)合用藥組(r.組),以黃茂多糖的H3濃度和順鉑的S2濃度聯(lián)合應(yīng)用;空白對(duì)照組(0組)不加藥,以等量培養(yǎng)液代替.
　　4.M'I'T試驗(yàn):將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的EC9706細(xì)胞以2x10'/L濃度200閃接種于%孔培養(yǎng)板上,RPMI1640培養(yǎng)基孵育24h后,傾去培養(yǎng)液.將H,S組的藥物分別加人孔內(nèi),每孔加200},l,對(duì)照組加同量培養(yǎng)液.孵育24h后,傾去藥液及培養(yǎng)液,每孔加人MTT(5群工)20閃培養(yǎng)4h,傾去藥液及培養(yǎng)液,每孔加人二甲基亞礬(DMSO)150},l,平板振蕩儀振蕩100min,在2500酶標(biāo)儀上以490nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度(9)值,計(jì)算抑制率(%)(1一各藥物濃度組A值)/對(duì)照組A值x.
　　5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同藥物作用細(xì)胞凋亡:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的人食管癌細(xì)胞調(diào)整濃度至2x108/L細(xì)胞懸液,2ml/孔接種于6孔板,RPMI1640培養(yǎng)基孵育48h后,分別加人H3,S2,L組各處理組藥物,繼續(xù)培養(yǎng)24h,收集各處理組EC9706細(xì)胞,用磷酸鹽緩沖液(PB幻洗滌細(xì)胞,二次收集1x105一5x105個(gè)細(xì)胞,加入5000,1的結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞,加人5閃llnnexinV/異硫氰酸熒光素(FITC)混勻后,再加人PI10閃,旋渦混勻,室溫避光染色15min;加人300閃結(jié)合緩沖液,進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測(cè).
　　6.細(xì)胞免疫化學(xué):常規(guī)制作細(xì)胞爬片,培養(yǎng)48h后,4%多聚甲醛溶液固定.按免疫組織化學(xué)SP法步驟進(jìn)行,用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照.bcl-2,bax主要在胞質(zhì)表達(dá),NF-rcB多定位于胞質(zhì),少數(shù)表達(dá)于胞核,呈棕黃色,空白對(duì)照呈陰性.200倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野,計(jì)算每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總計(jì)數(shù)細(xì)胞的>10%者為陽(yáng)性,平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%者為陰性(包括沒(méi)有或僅有弱的染色),陽(yáng)性反應(yīng)者用德國(guó)LeicaQ550cw圖像分析系統(tǒng)在統(tǒng)一光強(qiáng)、統(tǒng)一放大倍數(shù)(200x)下測(cè)量蛋白表達(dá),以染色淡的視野為起點(diǎn),隨機(jī)選取視野測(cè)定其灰度值作為陽(yáng)性表達(dá)的量化指標(biāo),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.
　　7.Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá):收集藥物作用后的EC9706各組細(xì)胞,提取總蛋白,用超微量紫外分光光度儀定量蛋白.十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDS-PAGE),半干法轉(zhuǎn)膜.50州L脫脂奶粉窒溫封閉1h;lxTEST稀釋一抗,4℃過(guò)夜;TEST洗膜4次;TBST稀釋二抗室溫45min,洗膜3次,化學(xué)發(fā)光法顯色,X線膠片進(jìn)行顯影、定影、圖像分析.
　　8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(無(wú)士、)表示,應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn).
　　結(jié)果
　　1.不同藥物組對(duì)EC9706細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用:黃蔑多糖及順鉑不同濃度分別對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞作用24h后的細(xì)胞增殖抑制率比較.結(jié)果顯示,黃蔑多糖和順鉑對(duì)EC9706細(xì)胞增殖抑制作用均隨濃度升高而逐漸升一高;2g/L濃度黃蔑多糖對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制強(qiáng)度與2.5mg/L濃度的順鉑相似(表1).
　　2.不同藥物組對(duì)EC9706細(xì)胞凋亡的影響:選擇黃茂多糖的H3濃度及順鉑的S2濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn),采用Annexin-V/PI雙染法,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組藥物分別及聯(lián)合作用EC9706細(xì)胞48h后其凋亡,可見(jiàn)兩個(gè)單藥處理組和藥物聯(lián)合組均高于空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),黃蔑多糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力很弱,低于順鉑(P<0.05),但兩藥聯(lián)合組促凋亡能力高于任何1個(gè)單藥處理組(P<0.OS,圖1)3.黃蔑多糖作用前后EC9706細(xì)胞中bcl-2,bax蛋白表達(dá)的比較:正常bcl-2,bax蛋白主要在胞質(zhì)表達(dá),呈棕黃色均勻染色為陽(yáng)性表達(dá).對(duì)bcl-2,bax表達(dá)陽(yáng)性的樣本行圖像分析,測(cè)其灰度值作為其表達(dá)強(qiáng)度的量化指標(biāo).灰度值與實(shí)際表達(dá)強(qiáng)度成反比,即灰度值越低,陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng);灰度值越高,陽(yáng)性表達(dá)越弱.
　　

　　bcl-2在黃蔑多糖作用48h后表達(dá)降低,而bax表達(dá)上升,與空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表2)oWesternblot結(jié)果也顯示,與空白對(duì)照組比較,黃蔑多糖降低bcl-2表達(dá),提高bax的表達(dá)(圖2).
　　4順鉑及黃蔑多糖聯(lián)合順鉑作用前后EC9706細(xì)胞中NF-KB蛋白表達(dá)的比較:正常NF-KB蛋白主要在胞質(zhì)表達(dá),部分表達(dá)于胞核,呈棕黃色均勻染色.對(duì)陽(yáng)J性表達(dá)的樣本行圖像分析,測(cè)其灰度值作為其表達(dá)強(qiáng)度的量化指標(biāo).不同藥物作用48h后,空白對(duì)照組細(xì)胞中NF-KB灰度值為140.21土14.75,順鉑組灰度值為114.38士12.17,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸<0.05),黃茂多糖聯(lián)合順鉑組FC9706細(xì)胞中NF-KB表達(dá)灰度值為131.66118.83,與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與順鉑組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.OS)oWesternblot結(jié)果顯示,藥物作用48h后,順鉑組IKB磷酸化(pIKB耐蛋白表達(dá)強(qiáng)度高于黃蔑多糖聯(lián)合順鉑組(圖3).
　　討論
　　黃蔑多糖在體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都顯示出其一定的抗癌效果,可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)其凋亡bcl-2蛋自家族中的促凋亡蛋白如bax}bad和bid以及抑制凋亡蛋白bcl-2和bcl-xL之間保持著一定平衡,調(diào)節(jié)著細(xì)胞的線粒體凋亡途徑,許多抗腫瘤藥物就是通過(guò)上調(diào)bax/bad/bid蛋白或下調(diào)bc1-2/bcl-xL蛋白而促進(jìn)細(xì)胞凋亡·4-5.本研究結(jié)果證實(shí)黃蔑多糖以濃度依賴性的方式,通過(guò)抑制EC9706細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用,此過(guò)程中,黃茂多糖明顯降低了EC9706細(xì)胞中bcl-2蛋白的表達(dá),并提高了bax蛋白的表達(dá),可以推斷,通過(guò)降低bcl-2/bax表達(dá)比例而誘發(fā)線粒體凋亡途徑是黃蔑多糖促進(jìn)食管癌EC9706細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要機(jī)制.抗腫瘤治療中,不同作用機(jī)制的藥物聯(lián)合應(yīng)用往往可起到效應(yīng)疊加的效果,并能一定程度降低或避免單一藥物長(zhǎng)期應(yīng)用所導(dǎo)致的細(xì)胞耐藥情況,所以,鑒于黃蔑多糖的作用機(jī)制,其與非線粒體凋亡途徑依賴性的抗腫瘤藥物聯(lián)合,或能發(fā)揮更好的抗癌功效.有研究結(jié)果表明,化療藥物促進(jìn)NF-rcB的激活和高表達(dá),是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞抗凋亡的一個(gè)重要因素〔61.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,順鉑作用EC9706細(xì)胞48h后,雖然促進(jìn)了一定數(shù)量的細(xì)胞凋亡,但是pIKBa與NF-KB的表達(dá)也明顯上升,預(yù)示著進(jìn)一步的藥物治療將難以取得應(yīng)有的療效,這與臨床所面臨的化療失敗性質(zhì)相似,推測(cè)在順鉑治療過(guò)程中,可能激活和/或誘導(dǎo)NF-KB的高表達(dá),從而誘發(fā)了細(xì)胞耐藥.而黃蔑多糖與順鉑聯(lián)合治療組并未出現(xiàn)p1KB.和NF-rcB的高表達(dá),結(jié)合其遠(yuǎn)高于順鉑單藥的誘導(dǎo)凋亡能力,在此過(guò)程中,黃蔑多糖通過(guò)抑制NF-KB的表達(dá),保持了EC9706細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性,發(fā)揮一了其化療士曾敏的作用.
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