細(xì)胞與基因治療加速崛起，質(zhì)粒DNA有何優(yōu)勢(shì)？
文章來(lái)源：賢集網(wǎng)發(fā)布日期：2022-05-23瀏覽次數(shù)：277 基因治療產(chǎn)品通常由含有工程化基因構(gòu)建體的載體或遞送系統(tǒng)組成，根據(jù)基因載體類(lèi)型的特性差異，基因治療產(chǎn)品主要可分為以病毒為載體的基因治療產(chǎn)品、以質(zhì)粒 DNA 為載體的基因治療產(chǎn)品、RNA 類(lèi)基因治療產(chǎn)品，以及以細(xì)菌微生物為載體的基因治療產(chǎn)品，其通過(guò)在人體細(xì)胞內(nèi)，利用“細(xì)胞工廠”進(jìn)一步表達(dá)產(chǎn)物或編輯細(xì)胞基因發(fā)揮功能。
質(zhì)粒DNA基因治療藥物是以質(zhì)粒DNA為載體的基因治療產(chǎn)品。天然質(zhì)粒是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一類(lèi)獨(dú)立于染色體的遺傳成分，絕大多數(shù)為環(huán)形雙鏈DNA分子，能持續(xù)穩(wěn)定地游離于染色體外自主復(fù)制，也可能在一定條件下可逆地整合到宿主染色體上隨染色體的復(fù)制而復(fù)制，因此是基因克隆中常見(jiàn)的載體分子[2]。質(zhì)粒本身可以攜帶外源目的基因用于質(zhì)粒DNA基因治療藥物的開(kāi)發(fā)，也是CAR-T、mRNA等細(xì)胞與基因治療藥物的基本原料，而且隨科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)粒在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和環(huán)保、食品等領(lǐng)域都有了廣泛應(yīng)用。
何謂質(zhì)粒DNA
質(zhì)粒DNA能夠廣泛用于基因細(xì)胞治療和核酸藥物領(lǐng)域。
質(zhì)粒包裹在宿主菌/大腸桿菌中，中間的一小部分就是質(zhì)粒DNA。
從結(jié)構(gòu)上看，質(zhì)粒是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一類(lèi)獨(dú)立于染色體的自主復(fù)制的遺傳成分。除了酵母的殺傷質(zhì)粒是RNA質(zhì)粒外，迄今為止所有的質(zhì)粒無(wú)一例外都是屬于這種類(lèi)型的DNA分子。質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過(guò)細(xì)胞分裂傳遞到后代。
為了更好地適應(yīng)細(xì)胞的生理特點(diǎn)，質(zhì)粒主要以細(xì)長(zhǎng)并具有負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)的形式存在于原核細(xì)胞中。環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒DNA分子具有三種不同的構(gòu)型：超螺旋質(zhì)粒DNA；開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA和線性質(zhì)粒DNA分子。
質(zhì)粒DNA大部分都是雙鏈超螺旋的閉合環(huán)狀，少數(shù)是線性化的，且具有可轉(zhuǎn)移性、可整合性，以及拷貝數(shù)，后者分為松弛型和嚴(yán)緊型兩種狀態(tài)。
質(zhì)粒：細(xì)胞與基因治療的關(guān)鍵起始物料和生產(chǎn)的主要成本來(lái)源
質(zhì)粒具有共價(jià)封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，是獨(dú)立于宿主染色體進(jìn)行自主復(fù)制的核酸分子。質(zhì)粒常見(jiàn)于原核細(xì)菌和真菌中，典型的質(zhì)粒元件包括原核復(fù)制起點(diǎn)、抗性基因、多克 隆位點(diǎn)、啟動(dòng)子、目的基因篩選標(biāo)記和目的基因，細(xì)菌質(zhì)粒是細(xì)胞與基因治療中 常用的質(zhì)粒載體，用于大量擴(kuò)增DNA片段、進(jìn)行基因改造或者直接作為目的基因的 導(dǎo)入工具。
質(zhì)粒作為絕大部分細(xì)胞與基因治療產(chǎn)品的起始物料，其應(yīng)用場(chǎng)景非常廣泛。可作為 細(xì)胞與基因治療載體直接作用于人體，也可用作病毒載體生產(chǎn)的原料或者mRNA疫 苗生產(chǎn)的模版。盡管質(zhì)粒的工藝生產(chǎn)流程基本一致，但其不同的用途和在不同應(yīng)用 場(chǎng)景的質(zhì)量控制要求不同，決定了質(zhì)粒的生產(chǎn)規(guī)模和純度也是成本控制的關(guān)鍵。
質(zhì)粒工藝化生產(chǎn)流程包括逐級(jí)放大的菌體擴(kuò)增過(guò)程和下游純化過(guò)程，細(xì)胞與基因治 療中常用的載體AAV和慢病毒的生產(chǎn)都需要質(zhì)粒作為起始材料，因此每年需要大 量符合質(zhì)量要求的質(zhì)粒來(lái)滿足下游細(xì)胞與基因治療的市場(chǎng)需求。質(zhì)粒生產(chǎn)工藝中面 臨的大挑戰(zhàn)是大規(guī)模的生產(chǎn)放大和純化，即要維持高超螺旋結(jié)構(gòu)質(zhì)粒的比例，又 要保持高純度，以上兩點(diǎn)無(wú)論對(duì)于DNA疫苗還是對(duì)于下游病毒生產(chǎn)的效率與質(zhì)量 （如減少空殼率等）形成重大影響。
質(zhì)粒通常在大腸桿菌中發(fā)酵擴(kuò)增，提高大腸桿菌的生長(zhǎng)密度可擴(kuò)大質(zhì)粒的產(chǎn)量。但 細(xì)菌密度增加會(huì)帶來(lái)溶氧不足的問(wèn)題，不僅會(huì)降低質(zhì)粒產(chǎn)量，還會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒質(zhì)量下 降，具有超螺旋構(gòu)象的質(zhì)粒含量減少，給下游純化工藝帶來(lái)困難，也會(huì)間接提高生 產(chǎn)成本。對(duì)大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中的溶氧量問(wèn)題進(jìn)行優(yōu)化后，可使質(zhì)粒產(chǎn)量提高1至50 倍。
大腸桿菌的裂解包含化學(xué)方法（堿、洗滌劑、酶、滲透沖擊）和物理方法（加熱、 剪切、攪拌、超聲波和凍融），其中堿性裂解是常用的方法。堿裂解步驟中，pH 的控制和適當(dāng)有效的混合是關(guān)鍵，需要在狹窄的pH范圍內(nèi)使基因組DNA發(fā)生不可逆 變性且質(zhì)粒雙鏈需要保持完整，大規(guī)模質(zhì)粒生產(chǎn)中，裂解過(guò)程往往工藝重復(fù)性差， 難以控制；該階段的質(zhì)粒對(duì)剪切力非常敏感，質(zhì)粒損失較大，超螺旋也容易丟失， 影響產(chǎn)量和質(zhì)量。
質(zhì)粒生產(chǎn)過(guò)程中常用層析法或色譜法進(jìn)行純化，不同開(kāi)發(fā)階段和使用級(jí)別對(duì)質(zhì)粒的 質(zhì)量要求不同。質(zhì)粒純化的目的在于去除宿主DNA、RNA、蛋白和內(nèi)毒素以及非超 螺旋的質(zhì)粒變體，以滿足針對(duì)目標(biāo)產(chǎn)品的使用要求，純化過(guò)程的優(yōu)化可提高質(zhì)粒產(chǎn) 量、降低成本。質(zhì)粒作為細(xì)胞與基因治療藥品的生產(chǎn)原料，需要對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行 鑒別，確保目的基因序列及整合無(wú)誤；作為關(guān)鍵原材料或終產(chǎn)品，需要對(duì)其功能進(jìn) 行鑒定和控制；為保證安全性，對(duì)內(nèi)毒素、雜菌污染和支原體殘留的鑒別和檢測(cè)的 周期往往約30天左右，決定著質(zhì)粒生產(chǎn)批次放行的周期；此外，質(zhì)粒因?yàn)闊o(wú)法終端 滅菌，因此需要全程在封閉且獨(dú)立的生產(chǎn)車(chē)間進(jìn)行，且要避免交叉污染，因此自動(dòng) 化、封閉式的系統(tǒng)是未來(lái)趨勢(shì)。
當(dāng)使用高拷貝數(shù)質(zhì)粒、采用優(yōu)化的發(fā)酵工藝可獲得約1-2g/L的質(zhì)粒，但目前行業(yè)內(nèi)絕大部分公司的質(zhì)粒產(chǎn)量不到0.5g/L，工藝優(yōu)化的空間還非常廣闊。質(zhì)粒由于結(jié)構(gòu) 簡(jiǎn)單，且理化性質(zhì)相似，因此構(gòu)建一個(gè)平臺(tái)化的生產(chǎn)和純化工藝相對(duì)簡(jiǎn)單。質(zhì)粒生 產(chǎn)周期較短，上游發(fā)酵和下游純化罐裝工藝約需6天，但質(zhì)粒的質(zhì)量控制約需30天（主 要對(duì)支原體等檢測(cè)周期較長(zhǎng)），質(zhì)粒生產(chǎn)的年產(chǎn)能可達(dá)100批次。
綜上，質(zhì)粒生產(chǎn)的工藝優(yōu)化對(duì)于提升質(zhì)粒的產(chǎn)量和質(zhì)量具有極大的意義，在大腸桿菌大規(guī)模發(fā)酵、質(zhì)粒的提取和純化工藝上，目前仍然具有非常廣闊的優(yōu)化空間。
質(zhì)粒DNA基因治療藥物發(fā)展歷程
基因治療是隨著20世紀(jì)六七十年代DNA 重組技術(shù)、基因克隆技術(shù)等的成熟而發(fā)展起來(lái)的具革命性的醫(yī)療技術(shù)之一，1972年Friedmann等[3]提出采用基因療法作為治療人類(lèi)遺傳疾病的手段，而質(zhì)粒DNA在生物制藥領(lǐng)域發(fā)展的突破性進(jìn)展出現(xiàn)在1990年，Wolff等[4]將含有氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶、螢光素酶和β-半乳糖苷酶基因的質(zhì)粒鹽溶液注入到小鼠的骨骼肌中發(fā)現(xiàn)，在這種“裸”質(zhì)粒DNA分子中編碼的報(bào)告基因在肌肉細(xì)胞中表達(dá)，該重大發(fā)現(xiàn)開(kāi)啟了將質(zhì)粒DNA作為生物藥物用于治療或預(yù)防的可能性?？v觀近30年的發(fā)展，質(zhì)粒DNA基因治療藥物發(fā)展可以分為技術(shù)手段發(fā)展、臨床試驗(yàn)探索以及上市應(yīng)用3個(gè)階段
技術(shù)手段發(fā)展（1990-1999）
? 1990年，Wolff等發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA攜帶的目的基因可以在肌肉細(xì)胞中表達(dá)；
? 1991年，電穿孔技術(shù)應(yīng)用于質(zhì)粒DNA基因治療藥物的體內(nèi)注射，以提高質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率；
? 1996年，CpG序列被設(shè)計(jì)于質(zhì)粒載體中，以更好地激活DNA疫苗的免疫反應(yīng)；
? 1997年，納米顆粒技術(shù)應(yīng)用于質(zhì)粒DNA基因治療藥物；
? 1999年，快速大量注射質(zhì)粒DNA溶液進(jìn)行全身給藥技術(shù)開(kāi)始應(yīng)用[5]。
2臨床試驗(yàn)探索（2000—2010）
1994年，代號(hào)AT-0001的治療質(zhì)粒DNA基因治療藥物（目的基因?yàn)镮L-2）在澳大利亞開(kāi)展I期臨床試驗(yàn)，用于惡性黑色素瘤的治療，之后幾年，研究者們陸續(xù)開(kāi)展了臨床嘗試，大都宣告失敗。2001年，代號(hào)JP-0010的質(zhì)粒DNA基因治療藥物（目的基因?yàn)镠GF）在日本開(kāi)展I/II期臨床試驗(yàn)，用于外周動(dòng)脈缺血性疾病的治療（該藥物于2019年獲得日本有條件上市批準(zhǔn)）。截至2010年，質(zhì)粒DNA基因治療藥物數(shù)量的臨床試驗(yàn)累計(jì)達(dá)到約300個(gè)，約占基因治療臨床試驗(yàn)總數(shù)量的18%，適應(yīng)癥包括腫瘤、心血管疾病以及傳染病等多個(gè)領(lǐng)域，尤其在缺血性疾病方面，質(zhì)粒DNA基因治療顯示出較好的應(yīng)用前景。
3上市應(yīng)用（2011至今）
2011年，俄羅斯干細(xì)胞研究公司開(kāi)發(fā)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF165）裸質(zhì)?；蛑委熕幬铮ㄉ唐访麨镹euvasculgen），在俄羅斯獲批上市，用于治療動(dòng)脈粥樣硬化引起的外周動(dòng)脈缺血性疾?。?019年，日本AnGes公司開(kāi)發(fā)的重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）裸質(zhì)?；蛑委熕幬铮ㄉ唐访麨镃ollategene），在日本獲得有條件上市批準(zhǔn)，用于治療阻塞性動(dòng)脈硬化癥和血栓閉塞性脈管炎；2021年，印度Cadila 公司開(kāi)發(fā)的DNA疫苗ZyCoV-D獲得緊急授權(quán)許可，用于預(yù)防12歲以上人群的重組2019新型冠狀病毒感染。ZyCoV-D是世界上第一個(gè)被批準(zhǔn)用于人類(lèi)的DNA疫苗，預(yù)示著針對(duì)各種疾病的DNA疫苗的到來(lái)。
質(zhì)粒DNA基因治療藥物研發(fā)現(xiàn)狀
截至2022年4月份The journal of gene medicine的統(tǒng)計(jì)結(jié)果[6]，全球范圍內(nèi)質(zhì)粒DNA基因治療藥物的臨床試驗(yàn)共開(kāi)展482個(gè)，占基因治療臨床試驗(yàn)總量的14.7%，僅次于以腺病毒以及逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體的基因治療臨床試驗(yàn)數(shù)量
從目的基因角度分析，基因治療藥物使用的目的基因包括受體、抗原、細(xì)胞因子等，而質(zhì)粒DNA基因治療藥物的目的基因主要集中于抗原、血管生長(zhǎng)因子以及細(xì)胞因子，其中以抗原為目的基因的DNA疫苗的臨床試驗(yàn)方案數(shù)量多，占比約36%，主要用于腫瘤及感染性疾病的治療，血管生長(zhǎng)因子類(lèi)的數(shù)量次之，占比約21%，主要包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）等，具有促進(jìn)血管新生的作用，主要用于治療缺血性疾病。
從研發(fā)階段上分析， 基因治療藥物的臨床試驗(yàn)超過(guò)50%為Ⅰ期階段，進(jìn)入Ⅲ期的臨床試驗(yàn)數(shù)量?jī)H不到5%， 質(zhì)粒DNA基因治療藥物所處各臨床試驗(yàn)階段的比例同上述數(shù)據(jù)基本一致，其中處于Ⅰ期臨床試驗(yàn)階段的超過(guò)250個(gè)，處于Ⅲ期階段的僅有約20個(gè)方案，表明質(zhì)粒DNA基因治療藥物仍然大部分處于臨床研究的早期階段。
