氧化應(yīng)激對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞NFκB、iNOS和NO信號(hào)表達(dá)的影響

 何姜,陳閩,劉小鶯,王燕萍 作者單位：福建醫(yī)科大學(xué) 附屬協(xié)和醫(yī)院，福建省內(nèi)分泌研究所，福州

　　【摘要】目的:觀察氧化劑第三丁基過(guò)氧化氫(tBHP)對(duì)體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞存活率及核轉(zhuǎn)錄因子κB(NFκB)、iNOS和一氧化氮(NO)的影響。 方法 體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，用不同濃度的tBHP處理，具體如下：(1)檢測(cè)細(xì)胞存活率。tBHP作用濃度分別為12.5，25，50，100 μmol/L，作用時(shí)間分別為30，60，90，120 min，采用MTT法觀察;(2)檢測(cè)NFκB p65、iNOS蛋白表達(dá)量及細(xì)胞內(nèi)NO水平。tBHP的作用濃度為50 μmol/L，作用時(shí)間分別為30，60，90，120 min，采用Western blot測(cè)NFκB p65、iNOS蛋白表達(dá)量，Griess化學(xué)顯色法測(cè)細(xì)胞內(nèi)NO水平;(3)iNOS抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯(LNAME，600 μmol/L)預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞24 h，用Griess化學(xué)顯色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NO水平。 結(jié)果tBHP可降低內(nèi)皮細(xì)胞的存活率，且呈時(shí)間及劑量依賴(lài)性，50 μmol/L tBHP作用30 min細(xì)胞核NFκB活化片段p65蛋白表達(dá)達(dá)高峰，作用60 min細(xì)胞質(zhì)iNOS蛋白達(dá)高峰;iNOS抑制劑LNAME可明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞NO升高。 結(jié)論 氧化應(yīng)激可引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其效應(yīng)可能通過(guò)NFκB iNOS NO途徑介導(dǎo)。

　　【關(guān)鍵詞】 第三丁基過(guò)氧化氫; 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞; 氧化損傷;核因子κB; 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶; 一氧化氮

　　ABSTRACT: ob[x]jective To explore the effects of Tertbutyl hydroperoxide(tBHP) on NFκB, iNOS and NO in human umbilical vein endothelial cells. Methods Human umbilical vein endothelial cells were cultured in vitro. Cells viability was measured by MTT assay. Nitric oxide levels were measured by Griess assay. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) protein and NFkBP65 fragment were detected by Western blot. Results Cell viability was reduced in a timeanddosedependent manner after exposure to tBHP at a range of 12.5～100 μmol/L for 30～120 min. The levels of cytoplasmic iNOS protein were elevated and reached a peak at 60 min. The ex[x]pression of nucleus NFkB p65 fragment reached a peak at 30 min after the treatment with tBHP. The levels of Nitric oxide were markedly attenuated after the treatment with LNAME 600 μmol/L for 24 hours. Conclusion NFκBiNOSNO signalling pathway can mediate tBHP induced damage in human umbilical vein endothelial cells.

　　KEY WORDS: Tertbutyl hydroperoxide; human umbilical vein endothelial cell; oxidative damage; nuclear factorκB; inducible nitric oxide synthase; nitric oxide

　　血管內(nèi)皮細(xì)胞參與機(jī)體的凝血、免疫、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和生物活性物質(zhì)釋放等重要的生命活動(dòng)，內(nèi)皮細(xì)胞的損傷在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[1]?，F(xiàn)已明確氧化應(yīng)激增強(qiáng)及氧自由基激活會(huì)引起內(nèi)皮細(xì)胞功能的障礙，但其分子機(jī)制尚不清楚[2]。已知核轉(zhuǎn)錄因子κB(NFκB)參與調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的多種基因表達(dá)，而腫瘤壞死因子α(TNFα)、白細(xì)胞介素1β(IL1β)等細(xì)胞因子均為NFκB的有效激活物，由此推測(cè)氧化應(yīng)激可能是通過(guò)NFκB介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷[3]。本研究采用氧化劑第三丁基過(guò)氧化氫(tBHP)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷，觀察內(nèi)皮細(xì)胞存活率、細(xì)胞核NFκB、細(xì)胞質(zhì)iNOS蛋白及胞內(nèi)NO水平的變化，探討氧化應(yīng)激對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用及其信號(hào)通路。

　　1 材料與方法

　　1.1 藥物及試劑

　　tBHP[(CH3)3COOH]、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、左旋硝基精氨酸甲酯(LNAME，美國(guó)Sigma公司)，NFκB p65多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，iNOS多隆抗體(美國(guó)Millipore公司)，βactin單克隆抗體(武漢博士德公司)，一氧化氮試劑盒(廈門(mén)碧云天生物技術(shù)研究所)，Western blot化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(廈門(mén)天根生化科技有限公司)。

　　1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

　　選第5～8代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC，上海拜力生物有限公司)，用含10%的胎牛血清(FBS)的改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約80%細(xì)胞匯合時(shí)消化。6孔板每孔接種細(xì)胞5×105 mL-1，培養(yǎng)16 h后，用不同濃度的tBHP處理，對(duì)照組以新鮮無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。于規(guī)定時(shí)間檢測(cè)NFκB、iNOS和NO等各項(xiàng)指標(biāo)。

　　1.3 細(xì)胞存活率MTT法測(cè)定

　　取上述培養(yǎng)的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，共5×104個(gè)細(xì)胞，不同濃度(12.5，25，50，100 μmol/L)的tBHP作用30，60，90，120 min，每孔加5 mg/mL MTT溶液10 μL，37 ℃孵育4 h，加DMSO終止孵育，495 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度A值，計(jì)算細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

　　1.4 NFκB p65及細(xì)胞質(zhì)iNOS蛋白測(cè)定

　　經(jīng)50 μmol/L的tBHP作用30，60，90，120 min后的HUVEC，分別作以下處理：(1)一部分HUVEC先用裂解緩沖液A[mmol/L，HEPES 10(pH 7.9)，KCL 10，EDTA 0.1，EGTA 0.1，DTT 1，PMSF 0.5]400 μL冰上裂解細(xì)胞15 min，加入10% NP40(終濃度0.2%)震蕩20 s，6 000 r/min 4 ℃離心5 min，將沉淀重懸于50 μL裂解緩沖液B[mmol/L，HEPES 20(pH 7.9)，NaCl 0.42，MgCl2 1.5，EDTA 1，EGTA 1，DTT 1，PMSF 1]，冰上震蕩20 min，14 000 r/min 4 ℃離心5 min，上清液留測(cè)NFκB p65。(2)另一部分HUVEC用細(xì)胞裂解緩沖液[mmol/L，TrisHCL 10(pH 7.4)，NaCl 100，EDTA 1，EGTA 1，NaF 1，Na4P2O7 20，Na3VO4 2，0.1% SDS，0.5%(W/V)sodium deoxycholate，1%TritonX 100，1 mmol/L PMSF，60 μg/mL aprotinin，10μg/mL leupeptin]120 μL冰上裂解細(xì)胞20 min，將細(xì)胞刮下，混勻后4 ℃ 14 000 r/min離心15 min，吸取上清液，留測(cè)iNOS。(3)用BCA法蛋白定量并配平各上清液濃度，取配平后的各上清液35 μg，10% SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳分離蛋白，半干電轉(zhuǎn)移法將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜)上，室溫封閉1～2 h后加入1∶500的NFκB p65一抗及1∶1 000的iNOS一抗，4 ℃孵育過(guò)夜后用1∶2 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶耦聯(lián)的抗兔IgG二抗室溫下反應(yīng)2 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，X射線曝光底片。以βactin作為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

　　1.5 NO測(cè)定

　　應(yīng)用Griess反應(yīng)檢測(cè)亞銷(xiāo)酸根(Nitrite)，可代表產(chǎn)生的NO的相對(duì)量。HUVEC經(jīng)50 μmol/L tBHP作用不同時(shí)間30，60，90，120 min，用細(xì)胞裂解緩沖液裂解細(xì)胞(參見(jiàn)1.4中iNOS裂解液)，離心后留取上清采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，用NO測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞NO濃度，結(jié)果以NO濃度/蛋白含量比值表示。每組5個(gè)樣品對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

　　1.6 LNAME預(yù)處理后NO測(cè)定

　　LNAME(600 μmol/L)預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，50 μmol/L tBHP作用內(nèi)皮細(xì)胞120 min，應(yīng)用Griess反應(yīng)檢測(cè)NO(參見(jiàn)1.5)。

　　1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　數(shù)據(jù)用x±s表示，選擇單因素方差分析進(jìn)行多組間差異性統(tǒng)計(jì)，以P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2 結(jié)果

　　2.1 tBHP對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞存活率影響

　　內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)不同濃度tBHP(12.5～100 μmol/L)作用(30～120 min)后，MTT試驗(yàn)顯示，隨tBHP劑量增高及作用時(shí)間延長(zhǎng)，內(nèi)皮細(xì)胞的存活率下降(P<0.01)，表明tBHP可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，并呈時(shí)間及劑量依賴(lài)性(圖1)，且當(dāng)tBHP濃度為50 μmol/L時(shí)，不同時(shí)間細(xì)胞存活率區(qū)分明顯。

　　2.2 tBHP對(duì)NFκB p65、iNOS蛋白及NO表達(dá)的影響

　　(1)內(nèi)皮細(xì)胞核NFκB p65蛋白含量升高，30 min達(dá)高峰，之后下降，而細(xì)胞質(zhì)NFκB p65蛋白含量變化不明顯(圖2)。(2)內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)iNOS蛋白含量升高，60 min達(dá)到高峰，以后逐漸下降(圖3)。(3)tBHP作用60 min后細(xì)胞內(nèi)NO含量呈時(shí)間依賴(lài)性增高(P<0.001，圖4)。

　　2.3 LNAME預(yù)處理對(duì)tBHP誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞NO含量變化影響

　　與單純tBHP作用相比，LNAME預(yù)處理的內(nèi)皮細(xì)胞NO含量降低，接近正常水平(P<0.001，圖5)。

　　3 討論

　　糖尿病患者常見(jiàn)的并發(fā)癥是血管功能異常，心血管事件如冠狀動(dòng)脈性疾病和腦卒中的發(fā)生率比正常人多2～4倍，其中氧化應(yīng)激導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的重要因素[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)氧化劑tBHP處理的內(nèi)皮細(xì)胞，存活率下降，細(xì)胞核NFκB p65蛋白及細(xì)胞質(zhì)iNOS蛋白表達(dá)增加，胞內(nèi)NO水平增高，iNOS的抑制劑LNAME預(yù)處理可以抑制tBHP引起的NO水平增高。

　　NFκB能調(diào)節(jié)多種炎癥和免疫基因表達(dá)，是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，與細(xì)胞增生、轉(zhuǎn)化和凋亡等重要的病理生理過(guò)程密切相關(guān)[5]。它與抑制性蛋白IκB結(jié)合呈非活性狀態(tài)?？杀欢喾N刺激劑激活，如細(xì)胞因子、氧化劑、脂多糖、紫外線等。激活的NFκB與IκB解離，轉(zhuǎn)入核內(nèi)與靶基因的κB基序結(jié)合，增強(qiáng)其表達(dá)。近年研究表明，NFκB是應(yīng)激與炎癥反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)物[67]，NFκB能刺激IL1β、cmyc、TNFα基因表達(dá)，從而引起細(xì)胞凋亡[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，氧化劑tBHP引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷伴細(xì)胞核NFκB p65蛋白水平升高，30 min時(shí)升高顯著。NO具有很強(qiáng)的擴(kuò)張血管作用，有助于維持組織細(xì)胞的血液供應(yīng)，保證正常功能;但它又是一種典型的自由基，大量的NO可與超氧陰離子發(fā)生反應(yīng)，生成氧化性極強(qiáng)的過(guò)氧化亞硝酸陰離子(ONOO),引起脂質(zhì)過(guò)氧化，直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能，還可通過(guò)增加黏附分子及炎性因子的表達(dá)引發(fā)糖尿病慢性并發(fā)癥[9];此外，過(guò)多的過(guò)氧化亞硝酸鹽進(jìn)一步導(dǎo)致硝化酪氨酸水平增高及NO生物活性的降低，進(jìn)而造成DNA的損傷。在氧化應(yīng)激條件下，iNOS表達(dá)顯著增高，從而生成過(guò)量的NO造成內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。已有資料表明，tBHP通過(guò)NO介導(dǎo)引起血管平滑肌細(xì)胞損傷[10]。本研究顯示，氧化劑tBHP引起內(nèi)皮細(xì)胞NO水平升高，并隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而明顯增加，iNOS蛋白表達(dá)也增加(其中60 min升高明顯)，應(yīng)用iNOS抑制劑LNAME后能顯著抑制tBHP引起的細(xì)胞NO水平升高，提示iNOSNO介導(dǎo)tBHP對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。而NFκB p65蛋白表達(dá)增加更早出現(xiàn)(30 min增加顯著)，提示NFκB p65iNOSNO三者在效應(yīng)上的承接性。

　　綜上所述，tBHP可能通過(guò)NFκBiNOSNO途徑介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷。因此干預(yù)多種損害因素所引發(fā)的NFκB激活可望能減輕對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害，從而延緩或阻止動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生，這可能是預(yù)防糖尿病血管并發(fā)癥的一種新策略。本研究只觀察tBHP誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷過(guò)程中NFκBiNOSNO通路的變化，尚未觀察有關(guān)tBHP激活NFκB后下游其它轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物如TNFα的變化，以及NFκB上游的抑制蛋白(IκB)的變化及其相互關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

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