骨髓增生異常綜合征患者間充質(zhì)干細(xì)胞SDF-1基因的表達(dá)

　作者：張翼,達(dá)萬(wàn)明　　作者單位：解放軍總醫(yī)院血液科，北京 100853

　　【摘要】本研究探討骨髓基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)在骨髓增生異常綜合征(MDS)患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)中的表達(dá)水平。采集MDS的骨髓標(biāo)本，分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增MSC，觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行表型鑒定;以實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞SDF-1基因和內(nèi)參照磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因的表達(dá)水平，并與健康供者的表達(dá)水平相比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MDS患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞SDF-1基因的表達(dá)水平經(jīng)GAPDH校正后為1.53±0.92，與對(duì)照組(5.51±0.99)相比差異非常顯著(P<0.01)。結(jié)論：SDF-1基因在MDS患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高，SDF-1基因的異常表達(dá)可能影響MDS患者骨髓微環(huán)境的造血調(diào)控作用，是否可對(duì)MDS的發(fā)病機(jī)制及治療提供新的思路值得進(jìn)一步探討。

　　【關(guān)鍵詞】 骨髓增生異常綜合征

　　Abstract This study was aimed to investigate the ex[x]pression level of stromal cell derived factor-1 gene (SDF-1) in bone marrow mesenchymal stem cells (MSC) of patients with myelodysplastic syndrome (MDS).The MSC from bone marrow samples of MDS patients were isolated，cultured and expanded，the morphology and immunophenotype of MSC were analyzed.The ex[x]pression levels of SDF-1 and internal reference GAPDH in MSC of MDS patients were detected by real-time quantitative reverse transc[x]riptase polymerase chain reaction (RQ-RT-PCR) method and were compared with ex[x]pression levels of healthy donors. The results showed that the ex[x]pression levels of SDF-1 in MDS patients were significantly different from those in healthy donors (1.53±0.92 vs 5.51±0.99) (P<0.01). SDF-1 gene ex[x]pression levels in bone marrow MSC of MDS patients were significantly higher than that in MSC derived from healthy donors.It is concluded that the abnormal ex[x]pression of SDF-1 gene in MSC may influence the regulation of hematopoiesis of the bone marrow microenvironment in MDS patients and it is worthy of further investigation for new clue on etiological mechanism and treatment of MDS.

　　Key words myelodysplastic syndrome; mesenchymal stem cell; SDF-1 gene; real-time quantitative RT-PCR

　　骨髓增生異常綜合征 (myelodysplastic syndromes，MDS) 是一組以血細(xì)胞的質(zhì)和量異常為特征的血液系統(tǒng)異質(zhì)性疾病，迄今為止發(fā)病機(jī)制尚不明確。多數(shù)研究者認(rèn)為，MDS由造血干細(xì)胞的惡性克隆性增殖引起，關(guān)于骨髓造血微環(huán)境是否參與其發(fā)病目前還存在爭(zhēng)論[1]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)是骨髓造血微環(huán)境的重要成分，我們?cè)谛陆难芯恐邪l(fā)現(xiàn)，來(lái)源于MDS患者的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，其體外支持造血的功能顯著弱于健康者來(lái)源的MSC[2]，由此設(shè)想，骨髓造血微環(huán)境特別是間充質(zhì)干細(xì)胞功能的異?？赡苌婕癕DS的發(fā)病機(jī)制。基質(zhì)細(xì)胞衍生長(zhǎng)因子-1(SDF-1)屬于CXC型趨化因子，在骨髓間充質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)，與表達(dá)于CD34+ 造血干/祖細(xì)胞及白血病細(xì)胞上的受體CXCR4特異性結(jié)合，在骨髓微環(huán)境對(duì)造血的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)，SDF-1/CXCR4與急、慢性白血病等血液系統(tǒng)腫瘤中惡性造血細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖密切相關(guān)[3]，但對(duì)其在MDS發(fā)病中的作用尚缺少研究。為此我們進(jìn)行了初步研究，以實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)了SDF-1 基因在MDS 患者骨髓MSC中的表達(dá)，并與健康人MSC的表達(dá)水平相比較。

　　材料和方法

　　研究對(duì)象

　　8例未經(jīng)治療的MDS患者，依照2000年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)，7例為難治性貧血(RA)，1例為難治性貧血伴原始細(xì)胞增多(RAEB)，其中男8例，女2例，中位年齡52(34-78)歲。髂骨穿刺獲得骨髓穿刺物10 ml，標(biāo)本加肝素抗凝。同時(shí)采集8例健康供者的骨髓標(biāo)本作為對(duì)照。

　　間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)

　　骨髓標(biāo)本置于1.077 g/ml的Ficoll分離液(Biochrom公司)上，400×g離心20分鐘，收集單個(gè)核細(xì)胞，用PBS洗2次，以(2-4)×105/cm2的密度接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)體系為Dexter完全培養(yǎng)液(Invitrogen公司)。72小時(shí)后去除非貼壁細(xì)胞，每周換液2次。待細(xì)胞生長(zhǎng)至瓶底90%融合時(shí)，以0.25%的胰蛋白酶消化，1∶3傳代。

　　RNA提取

　　用TRIzoL試劑 (Invitrogen公司) 從間充質(zhì)干細(xì)胞中提取總RNA。紫外分光光度儀測(cè)定260和280 mm處的吸光值，計(jì)算RNA濃度和純度。

　　cDNA逆轉(zhuǎn)錄合成

　　逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μl，包括標(biāo)本RNA 1 μg，隨機(jī)引物100 ng和逆轉(zhuǎn)錄酶等，42℃條件下反應(yīng) 1 小時(shí)，-20℃保存?zhèn)溆谩?br />
　　實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)

　　SDF-1 基因引物由Prime ExpressTM軟件 設(shè)計(jì)完成，上游引物：5′-GCCTGAGCTACAGATGCCCA-3′;下游引物：5′-TTCGGGTCAATGCACTTGT-3′。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因的表達(dá)作為內(nèi)參照，其上游引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′;下游引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。在ABI Prism 7700(美國(guó)Applera Corporation，Norwalk公司)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增。反應(yīng)體系25 μl，包括上、下游引物各0.3 μmol/L，Sybr Green PCR Master mix(美國(guó)Applera Corporation，Norwalk公司) 12.5 μl及10 ng cDNA。

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

　　為保證PCR擴(kuò)增的有效性及分析的準(zhǔn)確性，首先從人Stro-1+MSC細(xì)胞系(法國(guó)Morad.Bensidhoum博士建系并提供)中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，連續(xù)稀釋為0.1-50 ng/5 μl的濃度系列，進(jìn)行SDF-1和GAPDH的實(shí)時(shí)擴(kuò)增，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以cDNA濃度為橫坐標(biāo)，CT值(cycle at threshold，即PCR擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù))，計(jì)算曲線的相關(guān)系數(shù)r值，以>0.99認(rèn)為結(jié)果可靠。

　　SDF-1基因表達(dá)的計(jì)算方法

　　以CT值代表PCR擴(kuò)增的相對(duì)產(chǎn)量;ΔCT 表示靶基因SDF-1基因與GAPDH基因的之間CT差值，即ΔCT(MDS患者SDF-1基因)=CT(MSD患者SDF-1基因)-CT(GAPDH)，ΔCT(正常供者SDF-1基因)=CT(正常供者SDF-1基因)-CT(GAPDH);ΔΔCT=ΔCT(MDS患者SDF-1基因)-ΔCT(正常供者SDF-1基因)。

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　以ANOVA檢驗(yàn)比較靶基因SDF-1在MDS患者和健康供者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)，以P<0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　結(jié) 果

　　MDS患者間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)及表型鑒定

　　從MDS患者骨髓中獲取的單個(gè)核細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，72小時(shí)后去除懸浮細(xì)胞即可見貼壁細(xì)胞，細(xì)胞呈典型的成纖維細(xì)胞樣，2-3周后出現(xiàn)致密的貼壁層(圖1)。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)CD73(SH3)、CD105(SH2)及CD90(Thy-1)，而CD34、CD45等造血細(xì)胞標(biāo)記為陰性，符合MSC的形態(tài)學(xué)和表型特點(diǎn)。

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線的r值

　　從人Stro-1+MSC細(xì)胞系中提取總RNA，以50 ng/5 μl，10 ng/5 μl，1 ng/5 μl，0.1 ng/5 μl 4種濃度的cDNA 進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，依照產(chǎn)物的CT值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線的相關(guān)系數(shù)r值 為0.9957，大于0.99，表明引物設(shè)計(jì)準(zhǔn)確，產(chǎn)物擴(kuò)增效率良好，分析可靠(圖2)。

　　SDF-1基因在MDS患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)水平

　　SDF-1基因在MDS患者和健康供者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中均有表達(dá)，其中CT(MSD患者SDF-1基因)為16.31±0.70，CT(MDS患者GAPDH)為14.78±0.89，ΔCT(MDS患者SDF-1基因)為1.53±0.92; 對(duì)照組正常供者CT(SDF-1基因)、CT(GAPDH)及ΔCT值分別為19.03±0.51，14.52±1.98，4.51±0.99。計(jì)算ΔΔCT=1.53-4.51=-2.98，這說(shuō)明SDF-1基因在MDS患者間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)水平高于對(duì)照組，經(jīng)ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)兩組間差異具有顯著性 (P<0.01) (附表)。Table.Relative ex[x]pression levels of gene SDF-1 in bone marrow mesenchymal stem cells of MDS patients and healthy donors as measured by real-time quantitative RT-PCR (略)

　　討論

　　骨髓增生異常綜合征(MDS)是造血系統(tǒng)惡性克隆性疾病，以髓內(nèi)造血活躍的同時(shí)伴有外周血造血細(xì)胞一系或多系的減少為特征。多數(shù)研究認(rèn)為，這種無(wú)效造血是由于干細(xì)胞水平的細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)的異常終導(dǎo)致造血細(xì)胞凋亡過(guò)剩所致，但迄今為止該病的確切發(fā)病機(jī)制尚不完全明了。骨髓造血微環(huán)境(hematopoietic microenvironment)是造血系統(tǒng)的重要組成部分，通過(guò)產(chǎn)生和分泌細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)等對(duì)造血細(xì)胞的生成和分化發(fā)揮著極其重要的作用。有研究表明，MDS患者的骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外并不能支持CD34+細(xì)胞的生長(zhǎng)[4]，這可能與其異常表達(dá)IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子有關(guān)[5，6]，但骨髓造血微環(huán)境在MDS的發(fā)病中到底扮演了何種角色，是否為該病的重要致病因素，目前仍無(wú)定論。

　　基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)是骨髓基質(zhì)表達(dá)的高效趨化因子，與其受體——表達(dá)于CD34+造血干/祖細(xì)胞(HSC/HPC)上的CXCR4特異性結(jié)合后在HSC/HPC的歸巢、定居骨髓、維持正常造血及由骨髓動(dòng)員至外周血的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[7，8]。研究表明，SDF-1/CXCR4還參與維持多種惡性血細(xì)胞的存活及其在骨髓等部位的浸潤(rùn)，因而被認(rèn)為參與了急性和慢性白血病、淋巴瘤及多發(fā)性骨髓瘤等血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病[3]。關(guān)于SDF-1/CXCR4在MDS患者骨髓中表達(dá)的報(bào)道尚為鮮見，只有Matsuda等[9]在其初步研究中通過(guò)ELISA法發(fā)現(xiàn)，MDS患者的骨髓表達(dá)高水平的SDF-1，其CD34+細(xì)胞的凋亡顯著高于正常對(duì)照組，CXCR4在CD34+細(xì)胞的表達(dá)在兩組間無(wú)顯著差異，但對(duì)SDF-1的趨化能力在MDS組卻顯著減弱。

　　間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是造血微環(huán)境的重要成分，近年來(lái)關(guān)于其多向分化等生物學(xué)特性及支持造血、免疫抑制等功能已屢見報(bào)道[10-12]，但MDS患者的間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性、功能及其是否參與MDS發(fā)病的研究卻鮮有報(bào)道。在近的研究中，我們以MDS患者的MSC為滋養(yǎng)層，接種臍血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行體外造血支持實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示MDS組的細(xì)胞總數(shù)和CFU-GM計(jì)數(shù)顯著低于正常對(duì)照組，由此我們推論MDS患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)質(zhì)的異?？赡芘cMDS的發(fā)病有關(guān)。MSC是SDF-1重要的表達(dá)細(xì)胞，因此我們?cè)噲D從分子水平探討SDF-1在MDS患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)，以實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)靶基因和內(nèi)參照基因酸GAPDH)基因的表達(dá)水平，并與健康供者的表達(dá)水平相比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組靶基因的表達(dá)水平經(jīng)GAPDH校正后為1.53±0.92，與對(duì)照組的4.51±0.99相比差異顯著，說(shuō)明該基因在MDS患者M(jìn)SC中顯著高表達(dá)，與Matsuda等報(bào)道的MDS患者M(jìn)SC從蛋白質(zhì)水平高表達(dá)SDF-1的結(jié)果一致，進(jìn)一步支持了我們關(guān)于骨髓造血微環(huán)境，特別是間充質(zhì)干細(xì)胞的異常涉及MDS發(fā)病機(jī)制的推斷，進(jìn)而為我們以SDF-1/CXCR4為靶分子治療MDS的新設(shè)想提供了初步的支持，有關(guān)這方面的更加深入的研究正在進(jìn)行中。

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