高白細胞性白血病的生物學(xué)特性研究

作者：吳輝菁,陳燕　　作者單位：華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液科，武漢 430022

　　【摘要】 本研究探討高白細胞性白血病(HAL)的生物學(xué)特點及其臨床意義。采用CD45/SSC雙參數(shù)散點圖設(shè)門，應(yīng)用三色流式細胞術(shù)，對48例HAL患者及73例NHAL患者骨髓標本進行免疫分型，并對其中74例進行核型分析。結(jié)果表明：HAL組骨髓象中紅系比例明顯低于NHAL組，差異具統(tǒng)計學(xué)顯著意義(P<0.05);AML中HAL組CD14陽性率明顯高于NHAL組，差異具統(tǒng)計學(xué)顯著意義(P<0.05);ALL中HAL組CD8陽性率明顯高于NHAL組，而CD22，cCD79a明顯低于NHAL組，差異具統(tǒng)計學(xué)顯著意義(P<0.05);HAL組與NHAL組在系列抗原專一表達及交叉表達上無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);HAL緩解率低于NHAL。結(jié)論：HAL比NHAL骨髓受抑程度更重，AML中單核細胞性白血病發(fā)生高白細胞性白血病的可能性高，ALL中HAL比NHAL更易于表達T系抗原，HAL的白血病細胞較NHAL處于更早分化階段，同時HAL預(yù)后不佳。

　　【關(guān)鍵詞】 高白細胞性白血病

　　Abstract The study was to investigate the biological characteristics of hyperleucocyte acute leukemia (HAL) and its clinical significance. Immunophenotyping was performed in 48 HAL patients and 73 NHAL patients by three-color flow cytometry analysis using CD45/SSC gating，meanwhile the cytogenetic analysis was performed in 74 patients. The results showed that as compared with NHAL group，HAL group had lower proportion of eryth-lineage in bone marrow (P<0.05); in AML，the CD14 ex[x]pression of HAL group was apparently higher than that of NHAL group (P<0.05); in ALL，HAL group had higher ex[x]pression of CD8 and lower ex[x]pression of CD22，cCD79a compared with NHAL group (P<0.05); the two groups had no significant difference in ex[x]pression of special lineage antigens and overlapping lineage antigens (P>0.05). The CR rate of HAL group was lower than that of NHAL group. It is concluded that bone marrow inhibition of HAL group is more severe than that of NHAL group. In AML，monocytic leukemia is easier to become into HAL than other leukemias. In ALL，T-lineage antigens of HAL group are more easily expressed than those of NHAL group; the leukemia cells of HAL group are naiver than those of NHAL group，meanwhile the prognosis of HAL is poor.

　　Key words hyperleucocyte acute leukemia; leukemia; immunophenotype

　　急性白血病外周血象中白細胞計數(shù)超過100×109/L時稱為高白細胞性白血病(hyperleukocytic acute leukemia，HAL)，約占急性白血病的5%-20%[1]，其起病急驟，進展迅速，緩解率相對較低[2，3]，屬急性白血病中的高危類型。為進一步了解其惡性本質(zhì)，現(xiàn)對1組高白細胞性白血病患者的生物學(xué)特點進行研究，希望能為高白細胞性白血病的臨床治療及預(yù)后分析提供參考。

　　材料和方法

　　病例

　　48例患者均為我院住院病人，均按我國AL診斷標準[4]明確診斷，以外周血WBC≥100×109/L者作為研究對象。48例中男32例，女16例，年齡2-71歲，中位年齡23歲。AML 26例，其中M1 5例，M2 7例，M3 3例，M4 2例，M5 9例。ALL 22例，其中L1 3例，L2 19例。另選同期住院的73例非高白細胞急性白血病(non-hyperleukocytic acute leukemia，NHAL)患者作為對照組，其中男40例，女33例，年齡2-79歲，中位年齡19歲。AML 41例，其中M1 8例，M2 16例，M3 9例，M4 2例，M5 6例。ALL 32

　　例，其中L1 5例，L2 24例，L3 3例。

　　形態(tài)學(xué)及細胞化學(xué)染色

　　骨髓及外周血涂片經(jīng)瑞氏染色分類計數(shù)，經(jīng)髓過氧化物酶(MPO)，氯醋酸AS-D奈酚酯酶(CE)、酸性非特異性酯酶(ANAE)及糖原(PAS)染色檢查，采用FAB分類標準確定各例急性白血病的類型。

　　免疫分型檢測

　　取肝素抗凝骨髓液2 ml，經(jīng)淋巴細胞分離液分離獲取單個核細胞，采用直接免疫熒光技術(shù)三標記法分析，以CD45/SSC雙參數(shù)散點圖設(shè)門，測定結(jié)果采用CellQuest軟件進行分析。流式細胞儀為FACS Calibur，以FITC、PE、PRECP作為熒光劑標記抗體。單克隆抗體的選擇包括髓系相關(guān)的CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33、CD117、Mpo;T系相關(guān)的CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8;B系相關(guān)的CD10、CD19、CD20、CD22、cCD79a，干/祖細胞系的CD34、HLA-DR(以上試劑，儀器均由美國Becton Dickinson公司生產(chǎn))。結(jié)果判斷：通過CD45/SSC設(shè)門識別白血病幼稚細胞，分析計算該幼稚細胞群中各白血病相關(guān)抗原的陽性率;除MPO≥10%為陽性外，其他抗原陽性率以≥20%計算為陽性。

　　細胞遺傳學(xué)檢測

　　均采用骨髓細胞直接法，按常規(guī)收獲骨髓細胞制備染色體標本進行G顯帶處理，根據(jù)《人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN)》的規(guī)定行核型分析。

　　治療方案

　　HAL組中12例曾進行白細胞單采術(shù)，次數(shù)為1-3次，其中3例單采3次后WBC仍大于100×109/L，其余白細胞增高均得到糾正。36例用羥基脲和(或)環(huán)磷酰胺預(yù)處理，其中4例至出院時WBC未降至50×109/L以下，其余在3-14天內(nèi)WBC小于50×109/L，中位時間為5天。HAL組中，33例進行聯(lián)合化療，NHAL組中，67例進行聯(lián)合化療。AML中除M3用維甲酸和(或)亞砷酸治療外，其余主要以DA或IA方案。ALL主要以DVCP或DVLP方案化療。療效判定按全國統(tǒng)一標準[4]。HAL組化療后6例至出院(死亡)時始終處于骨髓受抑階段，其余病人骨髓受抑中位時間為10天(5-15天)，NHAL組化療后骨髓受抑中位時間為10天(3-18天)，兩組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。

　　統(tǒng)計學(xué)分析

　　對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行t檢驗，χ2檢驗。

　　結(jié)果

　　外周血象及骨髓象

　　HAL組治療前白細胞計數(shù)中位值為146.7×109/L[(100.0-563.3)×109/L]，NHAL組為10.13×109/L[(0.6-86.7)×109/L]，兩組比較差異有顯著性(P<0.05);HAL組血紅蛋白計數(shù)中位值為70 g/L(43-129 g/L)，NHAL組為71 g/L(3.8-123 g/L)，兩組比較差異無顯著性 (P>0.05);HAL組血小板計數(shù)中位值為40×109/L[(8-338)×109/L]，NHAL組為37×109/L[(6-666×)109/L]，兩組比較差異無顯著性(P>0.05)。骨髓象中原始+幼稚細胞數(shù)，HAL組中位值為84.5%(50.5%-99.0%)，NHAL組為83.0%(21.5%-97.5%)，兩組比較差異無顯著性(P>0.05);紅細胞比例HAL組中位值為1%(0.5%-13.0%)，NHAL組為3.25%(0.5%-48.5%)，兩組比較差異有顯著性(P<0.05)。

　　HAL與NHAL組免疫表型的比較

　　HAL組及NHAL組均做過免疫分型檢測。結(jié)果顯示，M1中5例HAL及8例NHAL的髓系抗原陽性率高者均為CD33()，而CD13、CD15、MPO陽性率均超過50%;但NHAL中CD117陽性率()高于HAL組(40%)。淋系抗原中，HAL組CD4、CD19陽性率高(40%)，而NHAL中CD4、CD7為高(37.5%)。

　　M2中7例HAL的髓系抗原以CD13陽性率高()，而16例NHAL的髓系抗原以CD33、CD117、MPO同為高(93.8%)，在兩組中除CD11b及CD14外，其余抗原陽性率均超過50%。淋系抗原中，HAL組CD4，cCD79a陽性率高，但也僅28.6%;NHAL組中CD4陽性率高(56.3%)，其余抗原陽性率均低于50%。

　　M3中3例HAL及9例NHAL的髓系抗原以CD33陽性率均為高()，但HAL組中CD117亦達;而NHAL組中CD13陽性率則為，另外兩組中，除CD11b，CD14外，CD15陽性率亦低于50%。淋系抗原中，HAL組除CD4有2例陽性表達外(66.7%)，其余抗原均無人陽性表達;而NHAL組中僅CD2，CD4，CD22各有1例陽性表達(11.1%)。

　　M4中2例HAL的7種髓系抗原陽性率均為;2例NHAL中除Mpo為50%，CD14無1例陽性表達外，其余抗原陽性率亦為。淋系抗原中，HAL組及NHAL組均全部表達CD4()，而CD2在NHAL組有1例陽性表達(50%)。

　　M5中9例HAL及6例NHAL的髓系抗原陽性率高者均為CD33()，另HAL組除Mpo外，其余抗原陽性率均>50%。NHAL組中，除CD14外，其余抗原陽性率均>50%。淋系抗原中，HAL組及NHAL組中僅見CD4表達陽性率>50%，分別為88.9%及。

　　所有AML中，26例HAL及41例NHAL，髓系抗原陽性率高者皆為CD33(92.3%，97.6%)，而CD13、CD15、CD117、Mpo陽性率均大于50%;HAL組CD14陽性率(30.8%)明顯大于NHAL組(4.9%)，差異具有顯著性(P<0.05)。 淋系抗原中，除CD4陽性率在兩組中均>50%(61.5%，51.2%)外，其余均<20%。干/祖細胞系抗原中，除M3型較為特殊，HAL組僅1例表達HLA-DR，NHAL組僅1例表達CD34外，這兩種抗原無論在HAL組還是NHAL組，在各型AML中的陽性率均大于50%。AML中HAL組與NHAL組抗原表達情況與CR的關(guān)系.

　　ALL-L1中，3例HAL中有2例T系6種抗原陽性率均為66.7%;5例NHAL中，CD2，CD5，CD7陽性率高，但也僅40%。B系抗原中，HAL組僅CD19有1例陽性表達(33.3%)，而NHAL組中CD10，CD19，cCD79a陽性率均為高(80%)。髓系相關(guān)抗原中，HAL組除CD13，CD15，CD33各有1例呈陽性表達外(33.3%)，其余抗原均無1例陽性表達;NHAL組CD11b陽性率高，但也僅40%。干/祖細胞系抗原中，HAL組CD34，HLA-DR陽性率均為33.3%;NHAL組CD34陽性率為80%，高于HLA-DR(60%)。

　　L2中，19例HAL的T系抗原中陽性率高者為CD5，CD7，但也僅36.8%;24例NHAL中，CD4陽性率高，但也僅25%。B系抗原中，HAL和NHAL病例均為CD19陽性率高(84.2%，79.2%)，另HAL中CD10陽性率為68.4%，NHAL中CD10、CD22、cCD79a陽性率>50%。HAL和NHAL組髓系相關(guān)抗原中，均為CD13陽性率高(52.6%，50%)。干/祖細胞系抗原中，兩組均為HLA-DR陽性率(63.2%，91.7%)高于CD34(57.9%，70.8%)。

　　HAL中無1例L3;NHAL中3例L3均表達B系抗原CD10，CD19()，2例表達CD22，cCD79a(66.7%);無1例表達T系抗原;髓系抗原中僅見1例表達CD33(33.3%)。 干/祖細胞系的抗原中，HLA-DR陽性率()高于CD34(66.7%)。

　　所有ALL中，HAL組T系抗原陽性率高者為CD5，CD7(40.9%)，NHAL組則為CD4(21.9%)。B系抗原在兩組均為CD19陽性率高，分別為77.3%，81.3%，另HAL中CD10陽性率>50% (59.1%)，NHAL中CD10，CD22，cCD79a>50%。髓系相關(guān)抗原中，HAL組CD13陽性率高，為50%，NHAL組CD33則為高，但也僅40.6%。干/祖細胞系抗原中，兩組均為HLA-DR陽性率(59.1%，87.5%)高于CD34(54.5%，71.9%)。另外，HAL組CD8陽性率明顯高于NHAL組，而CD22，cCD79a陽性率明顯低于NHAL組，且差異均具統(tǒng)計學(xué)顯著意義(P<0.05)。ALL中，HAL與NHAL組抗原表達情況與CR的關(guān)系。

　　HAL的核型特點

　　26例AML高白細胞性白血病患者中，10例做過染色體核型分析，其中6例為正常核型，2例放棄治療，1例死亡，3例完全緩解。其余4例均為染色體易位，3例為t (15;17)(q22;q11)，1 例完全緩解，2例未緩解;1例為t(8;21)(q22;q22)，放棄治療。41例非高白細胞性白血病患者中，30例做過核型分析，其中13例為正常核型，11例完全緩解，2例未緩解。6例伴有染色體易位，其中3例為t(8;21)(q22;q22)，均達完全緩解;1例為t(15;17)(q22;q11)，完全緩解;2例為t(9;22)(q34;q11)，1例完全緩解，1例未緩解。另1例為del(17)(q25)，未達完全緩解，1例為dup(1)(q32-41)，完全緩解。其余9例為數(shù)目異常，其中除1例放棄治療，1例+21號染色體患者未緩解外，均達完全緩解。

　　22例ALL高白細胞性白血病患者中，13例做過核型分析，其中6例為正常核型，1例死亡，1例放棄，其余4例均未緩解。3例為染色體易位，分別為t(11;14)(p13;q11)，t(2;16)(p13;q22)，t(9;22)(q34;q11)，均未完全緩解。另4例為染色體數(shù)目異常，均完全緩解。32例非高白細胞性白血病患者中，21例做過核型分析，其中15例為正常核型，1例放棄，11例完全緩解，3例未緩解。1例伴染色體易位，為t(9;22)(q34;q11)，未緩解。其余5例為染色體數(shù)目異常，均達完全緩解。

　　討論

　　HAL屬急性白血病中的高危類型，易合并顱內(nèi)出血、梗死、ARDS等危及生命的并發(fā)癥;化療過程中大量白血病細胞死亡，易致“腫瘤溶解綜合癥”，組織凝血因子大量釋放，導(dǎo)致DIC發(fā)生及一系列代謝異常，從而加重患者病情，故HAL早期病死率較高[3]，預(yù)后差。本組資料中，26例AML高白細胞性白血病患者中M5 9例，發(fā)生率為34.6%;而NHAL的41例AML中M5僅為6例，發(fā)生率為14.6%，提示M5型發(fā)生高白細胞性白血病可能性大，但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著意義，國內(nèi)亦未見相關(guān)報道。在血象與骨髓象檢查中，HAL與NHAL在外周血血紅蛋白量、血小板計數(shù)及骨髓中原始細胞+幼稚細胞數(shù)方面均無顯著差異，但HAL組骨髓中紅系比例明顯低于NHAL組，提示HAL骨髓受抑程度較NHAL為重。

　　HAL免疫學(xué)特點尚未引起其他人注意，通過CNKI檢索，1997年至今國內(nèi)尚無人報道。AML中，無論是HAL還是NHAL，髓系抗原表達陽性率高均為CD33、CD13均高于文獻中Drexler[5]總結(jié)的758例AML中的表達率(81%，84%)，但HAL和NHAL之間其表達并無明顯差異。所以這兩種抗原作為髓系的特異性抗原較為可靠，但在HAL與NHAL的比較上沒有意義。CD14是髓系單核細胞相關(guān)性抗原，且被認為屬預(yù)后較差的免疫表型，國內(nèi)外報道在AML中的表達率約為20%左右[5]，在所有67例AML中，其表達陽性率為14.9%，本研究與此報道較為一致。但在HAL中，其陽性率高達30.8%，高于NHAL組的4.9%，且差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著意義，與前述M5型發(fā)生高白細胞性白血病可能性大剛好對應(yīng);即使單獨在M4，M5兩型中比較，CD14陽性率在HAL組也高于NHAL組，與前文所述HAL預(yù)后不佳亦剛好相符。

　　ALL中，無論是HAL組還是NHAL組，淋系相關(guān)抗原中陽性率高的均為CD19，CD10，此2種抗原均為B系抗原。從表1、表2也可看到B系抗原在2組中陽性表達率均明顯高于T系抗原，說明ALL中，B-ALL的比例高，與文獻[6，7]報道一致，但就在HAL與NHAL兩組之間的比較來說，B系抗原的表達并無明顯差異。另外，因為ALL-L1，HAL組主要表達T系抗原，而NHAL則主要表達B系抗原，是否提示，L1中T-ALL發(fā)生高白可能性高于B-ALL，但因病例數(shù)較少，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著意義。

　　HAL中CD8陽性率明顯高于NHAL組，而CD8是特異性的T細胞表面標記;另HAL中CD22，cCD79a的陽性率明顯低于NHAL組，而CD22，cCD79a均為較成熟的B細胞標記。以上兩者綜合起來，說明HAL比NHAL更易于表達T系抗原;而且HAL中，白血病細胞較NHAL組處于更早分化階段。

　　Ferrare等[8]對417例AML及370例ALL進行免疫分型，AML中系列專一性表達為65%，ALL為85%;交叉表達在AML中有31%，ALL有15%，其余為“裸細胞型”。但在本研究資料中，HAL組與NHAL組系列專一性表達均低于此報道，且HAL組更為明顯，這可能與檢測方法陽性判斷標準差異有關(guān)。雖然HAL組系列專一性表達率低于NHAL組，但2組差異并無統(tǒng)計學(xué)意義。而交叉表達中，多數(shù)是伴T系抗原表達，且多為CD4陽性，而CD4在M5中的陽性率在HAL組高達88.9%，在NHAL組更達，與王興兵等研究結(jié)果一致[9];若將CD4不包括在T系抗原中，則HAL組僅3例伴T系抗原表達，NHAL組也從26例減至11例，故CD4作為T系的特異性抗原應(yīng)有所保留。但是即使不將CD4包含在T系抗原中，HAL與NHAL組伴T系抗原表達者差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義。

　　ALL中，專一表達淋系抗原比例也明顯低于上述報道，和AML組相同，HAL組系列專一性表達者比例亦低于NHAL組，但2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而在髓系抗原中，HAL組CD13陽性率高，NHAL組CD33陽性率高，但這2種抗原在2組中的表達差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義。

　　AML中，HAL組專一表達髓系抗原CR率高于交叉表達者;ALL中專一表達B系抗原與伴髓系抗原表達者CR率相當，但有T系抗原表達者無1例達完全緩解，提示AML中HAL患者專一表達緩解率高;而ALL中無T系抗原表達緩解率高，但因病例數(shù)較少，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著意義。

　　據(jù)文獻[10]報道，在AL細胞遺傳學(xué)分析中，預(yù)后好的核型有t(8;21)，inv(16);其次為t(15;17)和正常核型。預(yù)后較差的不良核型有-5/5q-，-7/7q-，inv(3q)，11qabn，17qabn/I(17q)，del(20q)，完整的8，11，13，14號染色體三體，復(fù)雜的核型異常及del(16)(q22)等。在本研究中，無論是HAL組還是NHAL組，均未見與上述報道相關(guān)的不良核型，但即使同為預(yù)后較好的核型，HAL組的CR率亦低于NHAL組。26例AML高白細胞性白血病患者中，14例經(jīng)過聯(lián)合化療，7例達到完全緩解，緩解率為50%;41例非高白細胞性白血病患者中，36例經(jīng)過聯(lián)合化療，26例達到完全緩解，緩解率為72.2%。22例ALL高白細胞性白血病患者中，19例經(jīng)過聯(lián)合化療，7例達到完全緩解，緩解率為36.8%;32例非高白細胞性白血病患者中，31例經(jīng)過聯(lián)合化療，23例達到完全緩解，緩解率為74.2%。結(jié)合表1，表2也可以看到，無論在哪一種分類，HAL組緩解率均低于NHAL組，進一步驗證了高白細胞性白血病的預(yù)后不佳。

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