宮頸癌不同臨床分期放療抗拒與缺氧誘導(dǎo)血管新生的關(guān)系

作者：戴鈺輝,李小娟　　作者單位：河北省河北北方學(xué)院附屬醫(yī)院放射科
　　【摘要】 目的：探討不同臨床分期的宮頸癌放療抗拒與腫瘤缺氧誘導(dǎo)血管新生的關(guān)系及意義。方法　選取91例不同臨床分期的宮頸鱗癌放療患者，采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)乏氧細(xì)胞誘導(dǎo)因子(HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，并用CD105標(biāo)記新生微血管密度(MVD)。結(jié)果　隨著臨床分期的加重，腫瘤的放療抗拒增大。VEGF、HIF-1α在宮頸鱗癌Ⅱb～Ⅳ期放療后抗拒的陽性表達(dá)率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HIF-1α、VEGF與MVD在不同臨床分期之間存在正相關(guān)，且隨臨床分期的加重，MVD的計(jì)數(shù)逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論　隨著宮頸鱗癌的臨床分期加重，腫瘤的放療抗拒加重，HIF-1α、VEGF、MVD的表達(dá)與之相關(guān)，可作為宮頸鱗癌放療后判斷預(yù)后的可靠依據(jù)。
　　【關(guān)鍵詞】 腫瘤血管新生;HIF-1α;VEGF;放療抗拒

　　【Abstract】　ob[x]jective　To investigate the relationship and significance between radiotherapy resistance and angiogenesis induced by hypoxia in patients with cervical squamous cell carcinoma (SCC) at different clinical stages.Methods　91 patients with cervical SCC at different clinical stages who were treated by radiotherapy were enrolled in the investigation.The immunohistrochemical assay was used to detect the ex[x]pressions of HIF-1α，VEGF，COX-2，and microvessel density (MVD) was marked by CD105.Results　The radiotherapy resistance of cervical SCC was increased with the aggravation of clinical stages.The positive ex[x]pression rates of VEGF，HIF-1αat Ⅱb-Ⅳ stages after radiotherapy were significantly increased (P<0.05).There was a positive correlation between HIF-1α，VEGF and MVD at different clinical stages，furthermore，the count of MVD was gradually increased with the aggravation of clinical stages，and there was a significant difference (P<0.05).Conclusion　The radiotherapy resistance of cervical SCC is increased with the aggravation of clinical stages.There is a positive correlation between HIF-1α，VEGF，MVD and different clinical stages，which can be used as the reliable evidence for evaluating the prognosis of patients with cervical SCC after radiotherapy.

　　【Key words】　tumor angiogenesis;HIF-1α;VEGF;radiotherapy resistance

　　試驗(yàn)顯示，腫瘤乏氧對(duì)放射治療不敏感，而腫瘤血管的新生又可促進(jìn)乏氧細(xì)胞再氧合，進(jìn)而部分緩解腫瘤細(xì)胞缺氧情況，但其在放療抗拒中所扮演的角色仍然不清楚[1]。乏氧細(xì)胞誘導(dǎo)因子(HIF-1α)是缺氧條件下存在腫瘤內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，可直接調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)[2]，促進(jìn)腫瘤血管新生。本試驗(yàn)采用免疫組化SP法檢測(cè)HIF-1α、VEGF，用CD105標(biāo)記微血管密度(MVD)，研究不同臨床分期的宮頸鱗癌放療抗拒與缺氧誘導(dǎo)腫瘤血管新生的關(guān)系，以期為臨床放療宮頸鱗癌提供可靠依據(jù)。
　　1　資料與方法
　　1.1　一般資料
　　收集河北北方學(xué)院附屬醫(yī)院2007年1月至2009年12月宮頸鱗癌放療病例91例，年齡26～68歲，平均年齡46歲;臨床分期(FIGO)按2000年標(biāo)準(zhǔn)，Ⅱb期34例，Ⅲ期39例，Ⅳ期18例。放療前均經(jīng)病理證實(shí)。
　　1.2　方法

　　患者均采用直線加速器外照射全盆腔，總量DT50Gy/25次/5周 (DT30～35 Gy時(shí)中線遮擋4 cm);3周時(shí)，高劑量率內(nèi)照射(銥-192)，DT 5～7 Gy/次，1周1次/5～7周。A點(diǎn)劑量：內(nèi)照射2/3、外照射1/3;B點(diǎn)劑量?jī)?nèi)照射1/3，外照射2/3。放射治療前，患者均經(jīng)宮頸取材SP法免疫組化，病例醫(yī)師閱片、核實(shí)、診斷。
　　1.3　試劑

　　兔抗人HIF-1α、VEGF多克隆抗體、抗CD105單抗體，SP法試劑盒，MVD計(jì)數(shù)法。
　　1.4　判定標(biāo)準(zhǔn)

　　判定HIF-1位于細(xì)胞核，陽性細(xì)胞核染成棕黃色(圖1);VEGF為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，染成棕黃色(圖2);陽性細(xì)胞(10個(gè)高倍視野)的著色強(qiáng)度按無著色、黃色、棕黃色和棕褐色分別判為0、1、2、3分，0～2分為低表達(dá)，視為陰性，3～6分為高表達(dá)，視為陽性。根據(jù)1979年WHO(World Health Organization)實(shí)體瘤近期客觀療效標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量病變，完全緩解、部分緩解評(píng)定為放療敏感，無變化、惡化評(píng)定為放療抗拒。MVD判定按照Weinder報(bào)道方法，高倍鏡下(×100)計(jì)數(shù)CD105抗體陽性的血管數(shù)目(圖3)，任何與附近微血管，腫瘤細(xì)胞及其他結(jié)締組織明顯分離的褐染的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均被認(rèn)為是單個(gè)的微血管，計(jì)數(shù)5個(gè)100倍視野下的血管數(shù)目，結(jié)果用平均數(shù)表示。,圖1　HIF-1α表達(dá)于子宮頸鱗狀細(xì)胞癌胞漿(SP×200),圖2　VEGF表達(dá)于子宮頸鱗狀細(xì)胞癌胞漿(SP×200),圖3　子宮頸鱗狀細(xì)胞癌周圍微血管密度(CD105標(biāo)記 ×100)1.5　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析　應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以x-±s表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2　結(jié)果

　　2.1　HIF-1α與VEGF在不同臨床分期宮頸癌中表達(dá)與療效的關(guān)系
　　在相同臨床分期及不同臨床分期的宮頸鱗癌中均存在放療抗拒。隨著臨床分期的升高，腫瘤的放療抗拒增大。 HIF-1α在Ⅱb、Ⅲ、Ⅳ陽性率分別是20.6%(7/34)、30.7%(12/39)、50.0%(9/18)，VEGF在Ⅱb、Ⅲ、Ⅳ陽性表達(dá)率分別是26.4%(9/34)、46.1%(18/39)、66.7%(12/18)， HIF-1α、VEGF的表達(dá)在Ⅱb與Ⅲ、Ⅱb與Ⅳ、Ⅲ與Ⅳ比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。表1　HIF-1α與VEGF在不同臨床分期的宮頸鱗癌中的表達(dá)與療效的關(guān)系

　　2.2　宮頸癌組織中HIF-1α、VEGF的表達(dá)及MVD計(jì)數(shù)

　　HIF-1α、VEGF伴隨臨床分期的升高，MVD的計(jì)數(shù)逐漸增加，不同分期MVD計(jì)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HIF-1α、VEGF陽性表達(dá)與MVD計(jì)數(shù)呈正相關(guān)。
　　2.3　三種臨床分期中HIF-1α表達(dá)、VEGF的表達(dá)與MVD計(jì)數(shù)的相關(guān)性
　　HIF-1α表達(dá)與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)性(r=0.648，P<0.05)， HIF-1α表達(dá)與MVD計(jì)數(shù)呈正相關(guān)性(r=0.547，P<0.05)，VEGF的表達(dá)與MVD計(jì)數(shù)呈正相關(guān)性(r=0.876，P<0.05)。見表2。表2　HIF-1α、VEGF在不同臨床分期的宮頸鱗癌中的陽性表達(dá)與MVD的關(guān)系
　　3　討論

　　新生血管可為腫瘤生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)和氧，但瘤體新生血管的生長(zhǎng)與放療療效的關(guān)系并不明確。研究顯示，瘤體細(xì)胞乏氧可誘導(dǎo)HIF-1α、VEGF的表達(dá)明顯升高，可促進(jìn)腫瘤血管新生[3]。但同時(shí)又有利于抑癌基因(p53)的突變[4]，促使腫瘤細(xì)胞過度生長(zhǎng)，并抑制了腫瘤細(xì)胞的凋亡，有利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。因此，通過免疫組化染色監(jiān)測(cè)HIF-1α、VEGF和Weinder的方法計(jì)數(shù)MVD可以作為判斷宮頸鱗癌放射治療后抗拒的重要分子標(biāo)志物。
　　HIF-1α是缺氧條件下廣泛存在于人體的一種異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子[5]。VEGF是HIF-1α重要的靶基因，其表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游擁有HHIF-1α結(jié)合位點(diǎn)，即缺氧反應(yīng)元件(HRE)[6,7]，可與HIF-1α形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，從而啟動(dòng)和上調(diào)VEGF基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。因而在缺氧環(huán)境下VEGF基因的表達(dá)上調(diào)，及其相應(yīng)蛋白產(chǎn)物的增加，對(duì)放射治療的抗拒產(chǎn)生了重要影響。
　　近年來，腫瘤分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，VEGF和血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)在腫瘤血管新生中起重要作用[8]。這些新生的腫瘤血管可為癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲提供營(yíng)養(yǎng)和氧，同時(shí)電離輻射對(duì)細(xì)胞的效應(yīng)卻又強(qiáng)烈地依賴于氧的存在，這就產(chǎn)生了一定的矛盾點(diǎn);本課題組通過免疫組化方法檢測(cè)新生血管內(nèi)上的CD105(CD105抗原是一種高度糖基化1型膜蛋白，它存在于新生血管內(nèi)皮中)來標(biāo)記腫瘤MVD。本研究結(jié)果顯示，HIF-1α、VEGF隨著宮頸鱗癌臨床分期的提高而表達(dá)增強(qiáng)，呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，且HIF-1α、VEGF對(duì)宮頸鱗癌放療后的腫瘤血管新生形成正調(diào)控。Weinder的方法計(jì)數(shù)MVD研究顯示其同樣也伴隨著臨床分期的增高而增多。表明了不同臨床分期宮頸鱗癌患者細(xì)胞中HIF-1α、VEGF的表達(dá)陽性率的不同以及MVD的增高，可以影響宮頸鱗癌對(duì)放療的敏化程度，進(jìn)而影響宮頸鱗癌的放射治療效果[9]。
　　綜上所述，宮頸鱗癌是被證實(shí)具有多樣血管生成能力的人體惡性腫瘤之一。本研究通過監(jiān)測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)通路的激活及HIF-1α、VEGF的高表達(dá)，研究這些綜合因素對(duì)宮頸鱗癌血管的新生，及這些新生血管所提供的營(yíng)養(yǎng)和氧對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)侵襲和細(xì)胞對(duì)放射線敏感性關(guān)系的影響，進(jìn)一步闡明不同臨床分期的宮頸鱗癌對(duì)放射治療的抗拒是不同的，缺氧誘導(dǎo)血管生成與宮頸鱗癌抗拒之間確實(shí)存在相關(guān)關(guān)系。同時(shí)通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的結(jié)果分析說明，不同臨床分期的宮頸鱗癌確實(shí)存在著放射治療敏感性的個(gè)體差異性，即需要解決腫瘤放射治療個(gè)體化的問題。也通過這些數(shù)據(jù)為設(shè)計(jì)和實(shí)施個(gè)體化放射治療方案及放療前進(jìn)行個(gè)體腫瘤的放射敏感性預(yù)測(cè)提供極大的幫助，可以進(jìn)一步提高宮頸鱗癌放療的療效，提高宮頸鱗癌患者的5年生存率和生活質(zhì)量，為今后更深層次的分子生物學(xué)研究提供一個(gè)新視角。
　　【參考文獻(xiàn)】
　　1　余子豪，殷巍伯，徐國(guó)鎮(zhèn)主編.腫瘤放射治療學(xué).第4版.北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2008.232-320.

　　2　Wong C，Wellman TL，Lounsbury KM.VEGF and HIF-1αex[x]pression are increased in advanced stages of epithelial ovarian cancer.Gynecologic Oncology,2003,91：513-517.

　　3　Habeck H，Odemthal J，Walderich B，et al.Analysis of a zebrafish VEGF

　　receptor mutant reveals specific disruption of angiogenesis.Curr Biol,2002,12：1405-1412.

　　4　Tseng PL，Tai MH，Huang CC，et al.Overex[x]pression of VEGF is associated with positive p53 immunostaining in hepatocellular carcinoma (HCC) and adverse outcome of HCC patients.Journal of Surgical Oncology,2008,98：349-57.

　　5　Wenger RH，Gassmann M.Oxygen(es) and the hypoxia-inducible factor-1.Biological Chemistry,1997,378：609-616.

　　6　Nakayama K，Kanzaki A，Hata K，et al.Hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1 alpha) gene ex[x]pression in human ovarian carcinoma.Cancer Lett,2002,176：215-223.

　　7　Birner P，Schindl M，Obermair A，et al.ex[x]pression of hypoxia-inducible factor-1α in epithelial ovarian tumors： its impact on prognosis and on response to chemotherapy.Clin Cancer Res,2001,7：1661-1668.

　　8　李素文，朱寶坤，郝惠英，等.VEGF和MMP-9在宮頸癌組織中的表達(dá).河北醫(yī)藥，2009,31：2290-2291.

　　9　梁華茂.宮頸癌的病因研究進(jìn)展.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2010,13：3239-3241.