微小RNA-21真核表達(dá)載體構(gòu)建及其對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞程序性細(xì)胞凋亡4蛋白的影響

　　微小RNA(miRNA)是一種在真核生物中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生性RNAs，長約21一23個(gè)核昔酸，通過調(diào)節(jié)靶mRNA的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致降解或者翻譯抑制，在動(dòng)植物體中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，異常表達(dá)的miRNA、與許多腫瘤，包括甲狀腺乳頭狀癌都密切相關(guān)，在腫瘤的發(fā)生過程中起到癌基因或抑癌基因的作用，并和預(yù)后不良有關(guān)}3}omiR-21是發(fā)現(xiàn)較早的miRNA之一，也是目前發(fā)現(xiàn)與不同類型腫瘤相關(guān)miRNAs中多的1個(gè)}a}，其位于17q23.2染色體FRA17B脆性區(qū)域，具有自主轉(zhuǎn)錄單位。研究表明，miR-21在多種腫瘤中顯著高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建miR-21的真核表達(dá)載體pEZX-eGFP-miR-21，將其轉(zhuǎn)染至甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1中，使其在TPC-1中瞬時(shí)高表達(dá)，觀察高表達(dá)的miR-21對(duì)程序性細(xì)胞凋亡4(PDCD4)蛋白表達(dá)的影響。 　　

　　材料和方法 　　

　　1.材料:Lipofectamine2000，MReagent(Invitrogen公司)、miRNA提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司),miRNAcDNA第1鏈合成試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)、HiFi-MMLVcDNA第1鏈合成試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司),2xmicroRNAQPCRpremix(wiChSYBRandRox)(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)、質(zhì)粒抽提試劑盒。大腸桿菌DHSa由本室保存、限制性內(nèi)切酶,T4DNA連接酶等。 　　

　　2.miRNA-21基因合成及載體構(gòu)建:根據(jù)miRNA-21基因序列設(shè)計(jì)正、反義DNA序列。兩端分別加BamHI/HindIII酶切位點(diǎn)。將合成的單鏈DN.4經(jīng)退火后合成雙鏈DNA序列。pEZX-eGFP經(jīng)BamHI/HindIII雙酶切后電泳回收酶切產(chǎn)物。通過T4DNA連接酶將酶切后的質(zhì)粒和DNA片段16℃連接過夜。連接產(chǎn)物用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，菌落聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法篩選陽性菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定及測序。 　　

　　3.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1由本實(shí)驗(yàn)室保存;TPC-1的培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，370C,5%C0}培養(yǎng)轉(zhuǎn)染前1d，將處于對(duì)數(shù)期生長的甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1用0.5%胰蛋白酶進(jìn)行消化，計(jì)數(shù)后稀釋成所需的密度，在含DMEM完全培養(yǎng)基(不含抗生素)的6孔板中接種該細(xì)胞，每孔3x106個(gè)細(xì)胞，每組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。至細(xì)胞融合度達(dá)90%，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000TM，按說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為3組(每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔):(1)轉(zhuǎn)染pEZX-eGFP-miR-21重組質(zhì)粒組為實(shí)驗(yàn)組;(2)轉(zhuǎn)染pEZX空載體組為陰性對(duì)照組;(3)未轉(zhuǎn)染組為空白對(duì)照組。 　　

　　4.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞miRNA-21的表達(dá):pEZX-eGFP-miR-21重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞48h后，利用miRNA提取試劑盒提取總miRNA、用加尾法及莖環(huán)法分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，通過熒光PCR試劑盒用特異引物對(duì)miR-21進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)以U6作為內(nèi)參，進(jìn)行FQ-PCR反應(yīng)。 　　

　　5.Westernblot法檢測細(xì)胞PDCD4蛋白表達(dá):轉(zhuǎn)染48h后，去培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板倒扣在吸水紙上，吸干培養(yǎng)液;胰酶消化細(xì)胞后，加人細(xì)胞裂解液RIPA100閃，重懸細(xì)胞并反復(fù)吹打3一5min;轉(zhuǎn)人EP管后4℃12000r/min離心5min;吸取上清，考馬斯亮藍(lán)溶液定量處理后于十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酸胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠上電泳2h，以p一肌動(dòng)蛋白(日-actin)作為參照物，至澳酚藍(lán)剛跑出即終止電泳;取出凝膠，轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡20min;將切好的硝酸纖維素及凝膠置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡2h，按照海綿、濾紙、凝膠、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、濾紙、海綿的順序組裝后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)完膜后將膜用1x麗春紅染液于脫色搖床_[搖染5min，用水沖洗膜至看到膜上的蛋白條帶。 　　

　　將PVDF膜標(biāo)記后置于5%的脫脂奶粉(TBS配制)中封閉，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)2h，棄封閉液;將PVDF膜置于封閉袋中，加人兔抗人PDCD4IgG單抗(用5%的脫脂奶粉稀釋1:1000)，室溫下孵育2h，于脫色搖床上用TBST洗脫3次，每次10min;TBS洗脫后的PVDF膜置于新的封閉袋中，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔PDCD4(用TBST稀釋至1:2000)，室溫下孵育1h后，棄二抗，TBST洗脫;再用TBS洗脫10min;將PVDF膜用保鮮膜包好，凡B試劑1:1等體積混合后均勻覆蓋在PVDF膜表面，暗室中曝片。然后進(jìn)行顯影、定影及圖像處理。 　　

　　6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:計(jì)量資料均應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。兩樣本比較采用配對(duì)設(shè)計(jì)兩兩比較t檢驗(yàn)，組間顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析(One}'ayANOVA)，數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示。 　　

　　結(jié)果
　　1.miR-21的真核表達(dá)載體pEZX-eGFP-miR-21測序分析鑒定:經(jīng)過酶切驗(yàn)證分析正確的克隆送北京金唯智生物科技有限公司測序，測序結(jié)果與DNA序列數(shù)據(jù)庫GeneBank中的序列一致，經(jīng)測序，插人序列與GeneBank中錄人的miR-21-3'UTR序列同源性達(dá)98%以上。 　　

　　2.FQ-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞miR-21的表達(dá)差異:與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞中miR-21相對(duì)表達(dá)水平明顯上調(diào)，加尾法中是對(duì)照組的6.39倍(P<0.01);莖環(huán)法中是對(duì)照組的7.58倍(P<0.01);陰性對(duì)照組的細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.OS，表1,2)。miR-21FQ-PCR擴(kuò)增曲線及熔解曲線顯示引物特異性較好，無特異性擴(kuò)增和引物二聚體干擾。 　　

　　3.Westernblot結(jié)果:Westernblot結(jié)果顯示，3組細(xì)胞PDCD4蛋白條帶均存在，3組細(xì)胞價(jià)actin均有陽性表達(dá)，且表達(dá)量基本相同。利用QuantityOne軟件對(duì)PDCD4蛋白的相對(duì)含量進(jìn)行分析，可見:與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEZX(0.43士0.07)及未轉(zhuǎn)染(0.82士0.O5)的TPC-1比較，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEZX-eGEP-microRNA-21后，PDCD4編碼的蛋白表達(dá)降低((0.24士0.03,P<0.O5，圖1).
　　討論
　　甲狀腺癌多起病隱匿，常以無痛性甲狀腺結(jié)節(jié)為初臨床表現(xiàn)，早期診斷較為困難。因此，研究鑒定早期診斷預(yù)警分子，是目前甲狀腺癌臨床研究所面臨的瓶頸問題，有重要臨床意義。 　　

　　miR-21是目前發(fā)現(xiàn)的與不同類型的腫瘤相關(guān)miRNAs中多的1個(gè)基因。miR-21在多種腫瘤如肝癌、膽管癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌及其他頭頸部實(shí)體瘤中顯著高表達(dá)，但是，miR-21的表達(dá)水平在個(gè)別腫瘤中也會(huì)出現(xiàn)低表達(dá)，如促腎上腺皮質(zhì)素分泌型垂體瘤的miR-21表達(dá)量較正常垂體組織低2.4倍。根據(jù)以上大量研究結(jié)果提出了一種假說，高表達(dá)miRNAs通過抑制抑癌基因發(fā)揮癌基因作用，低表達(dá)miRNAs則失去對(duì)抑癌基因的抑制而發(fā)揮抑癌基因的作用。 　　　　PDCD4初是通過其在凋亡細(xì)胞中作為正性調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄本而鑒定出來的，與人核細(xì)胞翻譯起始因子(eIF4A)結(jié)合，從而抑制核糖體復(fù)合物的形成和蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，是重要的腫瘤抑制因子，在多種腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)或缺失狀態(tài)，通過抑制蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯來發(fā)揮其抑制腫瘤生長的作用。 　　
　　因此，PDCD4可以作為腫瘤疾病臨床診斷、判斷預(yù)后以及治療的觀察指標(biāo)。miR-21在甲狀腺乳頭狀癌中高表達(dá)〔72}，但對(duì)于miR-21在甲狀腺乳頭狀癌中的作用機(jī)制尚不清楚，基于此，我們采用在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的真核表達(dá)載體pEZX構(gòu)建重組質(zhì)粒pEZX-eGFP-miR-210測序結(jié)果顯示該載體構(gòu)建成功，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1后，由于真核載體pEZX含巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、氨節(jié)青霉素抗性基因和新霉素抗性基因以及牛生長激素基因(BGH)聚腺普酸加尾信號(hào)和猴病毒40(SV40)早期啟動(dòng)子、使miR-21在細(xì)胞中瞬時(shí)高表達(dá)。這為我們進(jìn)一步研究miR-21在甲狀腺乳頭狀癌中的作用提供了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1中miR-21表達(dá)增高可以導(dǎo)致PDCD4蛋白表達(dá)的降低。這提示在甲狀腺乳頭狀癌中PDCD4是miR-21的直接靶基因。在TPC-1中miR-21通過作用于PDCD4來抑制細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮癌基因的作用miR-21,PDCD4可以作為預(yù)警分子，用于甲狀腺乳頭狀癌的早期診斷。本研究結(jié)果表明，沉默細(xì)胞miR-21基因使PDCD4在甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中重獲表達(dá)，可能恢復(fù)PDCD4對(duì)癌細(xì)胞的生長抑制作用，進(jìn)而直接促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。 　　

　　參考文獻(xiàn) 　　

　　孫鐵為,王瑾,吳德全. 微小RNA對(duì)腫瘤影響的研究進(jìn)展[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2007,(12):1607-1608.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2007.12.066.
　　Zhang B,Pan X,Cobb GP. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors[J].Dev Bid,2007.1-12.
　　Takamizawa J,Konishi H,Yanagisawa K. Reduced ex[x]pression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival[J].Cancer Research,2004.3753-3756.
　　Krichevsky AM,Gabriely G. miR-21:a small multi-faceted RNA[J].Journal of Cellular and Molecular Medicine,2009,(1):39-53.doi:10.1111/j.1582-4934.2008.00556.x.
　　Fujita S,Ito T,Mizutani T. miR-21 Gene ex[x]pression triggered by AP-1 is sustained through a double-negative feedback mechanism[J].Journal of Molecular Biology,2008,(3):492-504.doi:10.1016/j.jmb.2008.03.015.
　　Chan SH,Wu CW,Li AF. miR-21 microRNA ex[x]pression in human gastric carcinomas and its clinical association[J].Anticancer Research,2008,(2A):907-911.
　　Si ML,Zhu S,Wu H. miR-21-mediated tumor growth[J].Oncogene,2007,(19):2799-2803.doi:10.1038/sj.onc.1210083.
　　Shibahara K,Asano M,Ishida Y. Isolation of anovel mouse gene MA-3 that is induced upon programmed cell death[J].Gene,1995.297-301.
　　Zhang H,Ozaki I,Mizuta T. Involvement of programmed cell death 4 in transforming growth factor-betal-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma[J].Oncogene,2006,(45):6101-6112.doi:10.1038/sj.onc.1209634.
　　Matsuhashi S,Narisawa Y,Ozaki I. ex[x]pression patterns of programmed cell death 4 protein in normal human skin and some representative skin lesions[J].Experimental Dermatology,2007.179-184.