—內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)聯(lián)研究

【摘要】目的對內(nèi)皮型一氧化氮合酶 (eNOS)基因-786T/C、4a4b、894G/T等3個多態(tài)性位點(diǎn)與中國漢族人群冠心病(CAD)發(fā)病的相關(guān)性進(jìn)行聯(lián)合研究。方法　148例中國漢族CAD患者和115例正常對照進(jìn)行以下遺傳學(xué)分析：應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)和PCR技術(shù)分析2個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)即-786T/C和894G/T，以及1個可變串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)位點(diǎn)4a4b，檢測各位點(diǎn)基因型和等位基因頻率，采用HaploView 4.0及SPSS 13.0軟件經(jīng)χ2檢驗(yàn)比較兩組間各位點(diǎn)基因型及等位基因頻率的差異。結(jié)果　CAD組中eNOS基因-786T/C位點(diǎn)CC基因型頻率以及4a4b位點(diǎn)4a/4a基因型頻率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CAD組和對照組在eNOS基因的894G/T位點(diǎn)等位基因和基因型頻率分布均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論　eNOS基因-786T/C和4a4b多態(tài)性與中國漢族人群CAD存在關(guān)聯(lián)，C等位基因和4a等位基因可能是CAD發(fā)病的危險因素。eNOS基因894G/T位點(diǎn)與CAD可能無關(guān)聯(lián)。
　　【關(guān)鍵詞】 冠狀動脈疾病;　一氧化氮合酶;　多態(tài)性;　限制性片段長度;　病例對照研究

　　【Abstract】　ob[x]jective　To investigate the relationship between the 3 polymorphisms (-786T/C,4a4b,894G/T) in endothelial nitric oxide synthase (eNOS) gene and coronary artery disease (CAD).Methods　148 patients with CAD and 115 healthy unrelated individuals in a Chinese Han population were involved.The genotype and allele frequencies of each polymorphisms of the eNOS gene in these patients and normal controls were examined with polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms (PCR-RFLP) or PCR methods.Genotypes and allele frequencies were analyzed by HaploView 4.0 and SPSS 13.0 software.Results　There were significant differences in both allele and genotype frequencies of -786T/C and 4a4b between the study and control group.The frequencies of CC genotype of the -786T/C and 4a/4a genotype of the 4a4b in eNOS gene were significantly higher in CAD than that in controls (P<0.05).Between patients with CAD and controls，there were no significant differences in the frequencies of the genotypes and alleles of the 894G/T in eNOS gene.Conclusions　The -786T/C and 4a4b polymorphisms of eNOS gene may be associated with CAD.The individuals with C allele of -786T/C and 4a allele of 4a4b are susceptible to CAD.Between CAD and normal controls，there is no significant association in the and 894G/T polymorphism in eNOS gene.

　　【Key words】　Coronary disease;　Nitric-oxide synthase;　Polymorphism，restriction fragment length;　Case-control studies

　　冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(disease，CAD)，是供應(yīng)心臟自身血液的冠狀動脈發(fā)生嚴(yán)重粥樣硬化或痙攣而狹窄或閉塞，導(dǎo)致心肌缺血缺氧或壞死的一種嚴(yán)重心臟疾病，是世界范圍內(nèi)首要的致死性心血管疾病[1]。包括年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病以及遺傳易感性等眾多因素都會影響CAD的發(fā)生發(fā)展[1-2]。大量研究表明：內(nèi)皮功能障礙在作為CAD基本病理表現(xiàn)的動脈粥樣硬化的發(fā)展過程中起到關(guān)鍵的作用，內(nèi)皮功能障礙程度可以間接反映CAD的發(fā)病程度并提供預(yù)后評估[3]。由內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)催化合成的一氧化氮(nitric oxide，NO)可以通過對血小板聚集，白細(xì)胞黏附和平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的抑制效應(yīng)發(fā)揮對心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用[3]。動物實(shí)驗(yàn)表明，eNOS基因敲除小鼠較之野生型小鼠更易患動脈粥樣硬化[4]?；诩蚁?、雙胞胎以及寄養(yǎng)子的遺傳分析研究表明，CAD的遺傳度高達(dá)50%，而eNOS基因已被認(rèn)為是CAD重要的候選基因[5]。
　　eNOS在血管中的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后過程的調(diào)節(jié)，提示eNOS基因表達(dá)的可誘導(dǎo)性改變很可能通過NO參與動脈痙攣或是CAD的發(fā)生發(fā)展[6-7]。近些年的遺傳學(xué)研究也試圖揭示不同人群eNOS基因變體與CAD發(fā)病的關(guān)系，受到人們廣泛關(guān)注的變體包括位于基因啟動子區(qū)的-786T/C，位于第七外顯子區(qū)的894G/T等單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點(diǎn)以及位于第四內(nèi)含子區(qū)的4a4b可變串聯(lián)重復(fù)序列(variable number of tandem repeats，VNTR)。雖然一些研究表明上述eNOS基因多態(tài)性位點(diǎn)或獨(dú)立或通過基因和環(huán)境的交互作用與CAD的發(fā)生具有關(guān)聯(lián)性，然而也有一些文獻(xiàn)并沒有發(fā)現(xiàn)這種關(guān)聯(lián)關(guān)系。這種矛盾表明不同人種不同族群CAD的易感位點(diǎn)和它對疾病的貢獻(xiàn)度可能存在某些差異。然而，在國內(nèi)尚未出現(xiàn)eNOS基因上述3個多態(tài)性位點(diǎn)的聯(lián)合研究。
　　基于以上原因，為了進(jìn)一步明確eNOS基因與中國漢族人群CAD的相關(guān)性，筆者通過采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)以及聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-polymorphism，restriction fragment length，PCR-RFLP)技術(shù)，在國內(nèi)檢測4a4b，-786T/C和894G/T三個多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，將148例CAD和115例健康人進(jìn)行對照，用病例-對照研究方法對eNOS基因上述2個SNP位點(diǎn)和1個VNTR位點(diǎn)的基因型及等位基因與CAD發(fā)病的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了探討。
　　對象與方法
　　一、研究對象
　　選取2007～2010年在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科住院的CAD患者148例，均符合1979年WHO關(guān)于缺血性心臟病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)冠狀動脈造影確診。造影時，各主要分支存在≥50%狹窄定義為有意義病變。其中男86例，女62例，平均年齡(62.2±13.7)歲。收集115例來自健康體檢的無關(guān)健康個體作為正常對照組，男67例，女48例，平均年齡(59.4±11.6)歲。所有受試者均為漢族，入組時均排除其他軀體精神疾病以及可能影響血液系統(tǒng)的其他疾病，同時簽署知情同意書。
　　二、研究方法
　　采用EDTA抗凝真空采血管收集外周血5 ml，采用北京天根公司基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩CR反應(yīng)體系25 μl：基因組DNA 100 ng，滅菌去離子水10 μl， 10×buffer 5 μl,2 mmol/L dNTPs 4 μl,20 μmol/L引物各0.5 μl，Taq酶(5 U/μl)。eNOS基因多態(tài)性位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[8-10]，由上海生工合成。-786T/C引物為：上游5′-CAGATGACACAGAACTACAA-3′，下游5′-GAGTCTGACATTAGGGTATCC-3′。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環(huán)，72 ℃總延伸15 min,4 ℃保存。10 μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物用10 U Nae Ⅰ限制性內(nèi)切酶(TaKaRa，大連)37 ℃過夜消化;894G/T引物為：上游5′-CATGAGGCTCAGCCCCAGAAC-3′，下游5′-AGTCAATCCCTTTGGTGCTCAC-3′。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)如下：95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環(huán)，72 ℃總延伸 15 min，4 ℃保存。10 μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物用10 U Ban Ⅱ限制性內(nèi)切酶(TaKaRa，大連)37 ℃過夜消化;VNTR 4a4b引物為：上游5′-AGGCCCTATGGTAGTGCCTTT-3′，下游5′-TCTCTTAGTGCTGTGGTCAC-3′。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)如下：95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性 30 s，60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環(huán)，72 ℃總延伸15 min,4 ℃保存。酶切產(chǎn)物及PCR產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)BIO-RAD凝膠成像儀系統(tǒng)處理后進(jìn)行基因分型判讀。
　　三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

　　采用HaploView 4.0軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，計(jì)算病例組和對照組間基因型頻率和等位基因頻率。采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和χ2 檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析臨床資料和等位基因、基因型頻率分布差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)　　果
　　一、 CAD組和健康對照組臨床特征比較
　　148例CAD患者和115例健康對照者的臨床資料見表1。CAD組和對照組除了在吸煙史和糖尿病史這兩項(xiàng)指標(biāo)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)外，平均年齡、體重指數(shù)、性別、高血壓史等指標(biāo)均未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　二、 CAD組和健康對照組eNOS基因3個多態(tài)性位點(diǎn)分型結(jié)果比較
　　eNOS基因-786T/C位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物為單一的338 bp條帶，Nae Ⅰ酶切后等位基因片段結(jié)果如下：CC型為195 bp和143 bp;CT型為338 bp、195 bp和143 bp;TT型為338 bp。
　　eNOS基因894G/T位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物為單一的207 bp條帶，Ban Ⅱ酶切后等位基因片段結(jié)果如下：GG型為125 bp和 82 bp;GT型為207 bp、125 bp和82 bp;TT型為207 bp。
　　eNOS基因4a4b位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)27 bp核心序列的重復(fù)次數(shù)不同分為：4a/4a型，27 bp重復(fù)4次，PCR產(chǎn)物為單一的108 bp條帶;4b/4b型，27 bp重復(fù)5次，PCR產(chǎn)物為單一的135 bp條帶;4a/4b型，雜合型，PCR產(chǎn)物為108 bp和135 bp條帶并存。
　　經(jīng)檢驗(yàn)，eNOS基因-786T/C、894G/T和4a4b三個多態(tài)性位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，群體具有代表性。上述eNOS基因3個多態(tài)性位點(diǎn)的基因型、等位基因頻率在正常與疾病組中的分布及統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。
　　eNOS基因-786T/C和4a4b位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率分布在CAD組與正常對照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CAD組的-786T/C位點(diǎn)的等位基因C頻率顯著高于正常對照組(χ2=7.449，P=0.006，OR=2.273,95% CI=1.245～4.151),4a4b位點(diǎn)的等位基因4a頻率顯著高于正常對照組(χ2=9.146，P=0.002，OR=2.193,95% CI=1.307～3.680)。而894G/T位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率分布在疾病和健康對照組之間均未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這些結(jié)果提示，eNOS基因-786T/C和4a4b位點(diǎn)多態(tài)性可能與CAD的發(fā)病有關(guān)，攜帶有-786T/C多態(tài)性位點(diǎn)C等位基因和4a4b多態(tài)性位點(diǎn)4a等位基因的個體更可能患CAD，而894G/T位點(diǎn)可能與CAD的發(fā)生發(fā)展沒有明顯的相關(guān)性。表1　CAD組和健康對照組臨床資料比較表2　eNOS基因3個多態(tài)性位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在CAD及正常對照組中的分布比較

　　討　　論
　　有關(guān)CAD發(fā)病的具體分子機(jī)制迄今仍未闡明。目前認(rèn)為，作為一種復(fù)雜性疾病，CAD致病過程是多因素的，涉及基因和環(huán)境的交互作用。吸煙等環(huán)境因素作為CAD發(fā)病的風(fēng)險因素早已為人們所認(rèn)識，筆者也在本研究中再次發(fā)現(xiàn)具有糖尿病史和吸煙史的人更易發(fā)CAD。然而，雖然近年來發(fā)現(xiàn)了一些CAD發(fā)病的候選基因如eNOS，遺傳因素獨(dú)立或是與環(huán)境因素疊加參與CAD的發(fā)生發(fā)展卻尚未有明確的結(jié)論。有的對于eNOS基因多態(tài)性與內(nèi)皮功能障礙和CAD患者臨床表現(xiàn)的相關(guān)性的遺傳學(xué)研究結(jié)果并不一致。而近年的薈萃分析的結(jié)果支持eNOS基因的某些遺傳變異可能能夠作為特定群體心血管疾病發(fā)病的危險因素之一，預(yù)測疾病的發(fā)生和發(fā)展[11]。
　　本次研究在國內(nèi)同時選擇eNOS基因上被人們廣泛關(guān)注的三個多態(tài)性位點(diǎn)，其中-786T/C位于啟動子區(qū)，有資料顯示該位點(diǎn)變異可能影響eNOS基因的轉(zhuǎn)錄起始，導(dǎo)致eNOS合成減少進(jìn)而使NO生產(chǎn)減少，促進(jìn)冠狀動脈的痙攣[12];屬于VNTR的4a4b位點(diǎn)位于第四內(nèi)含子區(qū)，有研究表明4a等位基因攜帶者血漿NO水平顯著降低[13];894G/T位點(diǎn)位于第七外顯子，可使eNOS蛋白密碼子298的谷氨酸被置換為天冬氨酸，有研究發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性位點(diǎn)與血液中NO濃度下降以及血管反應(yīng)性下降有關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，eNOS基因-786T/C位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率在CAD組與對照組均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CAD組C等位基因頻率和CC基因型頻率明顯高于對照組(P<0.05);4a4b位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率在兩組之間也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CAD組4a等位基因頻率和4a/4a基因型頻率明顯高于對照組(P<0.05)。而894G/T位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在兩組之間未發(fā)現(xiàn)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明，eNOS基因-786T/C和4a4b多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布與中國漢族人群CAD相關(guān)聯(lián)，等位基因C和等位基因4a可能是CAD的危險因子，攜帶有-786T/C多態(tài)性位點(diǎn)C等位基因和攜帶有4a4b多態(tài)性位點(diǎn)4a等位基因的個體可能更易發(fā)生CAD，而eNOS基因894G/T位點(diǎn)多態(tài)性分布與CAD發(fā)病沒有明顯的關(guān)系。
　　本研究結(jié)果支持-786T/C位點(diǎn)的C等位基因和4a4b位點(diǎn)的4a等位基因是CAD發(fā)病相關(guān)的危險因素，這與以往國內(nèi)研究結(jié)果相一致。冉軍川等[15]對中國漢族人群健康群體與CAD的研究表明：-786T/C基因多態(tài)性是CAD的遺傳危險因素，并獨(dú)立于CAD其他的經(jīng)典危險因素。向光大等[16]對2型糖尿病患者研究結(jié)果提示攜帶-786T/C多態(tài)性C等位基因明顯增高2型糖尿病患者并發(fā)CAD的危險性。于輝等[17]以及賀穎等[18]對我國河南地區(qū)漢族人群CAD發(fā)病易感性的研究結(jié)果表明eNOS基因的4a4b與CAD顯著相關(guān)，4a等位基因攜帶者具有易患CAD的危險性。然而對于國外的報道，結(jié)果卻并不一致。對于-786T/C位點(diǎn)，Nassar等[19]及Jaramillo等[20]均報道歐美人群CAD發(fā)病的危險性與-786T/C位點(diǎn)多態(tài)性無關(guān)，而Nakayama等[8]、Kim等[21]以及Alkharfy等[22]則報道亞洲人群即日本、韓國以及沙特阿拉伯人群該位點(diǎn)C等位基因與CAD發(fā)病均顯著相關(guān)。對于4a4b位點(diǎn)，也未有一致結(jié)論，高加索人群的研究既有4a等位基因與CAD發(fā)病相關(guān)的報道[9,23]，也有陰性結(jié)果的發(fā)現(xiàn)[24]，而對于亞洲人群，Ichihara等[25]、Park等[26]以及Alkharfy等[22]的研究認(rèn)為亞洲人群即日本、韓國以及沙特阿拉伯人群該位點(diǎn)4a等位基因能顯著升高CAD的發(fā)病危險性。綜合分析以往的研究結(jié)果并結(jié)合筆者的研究發(fā)現(xiàn)，可以認(rèn)為：eNOS基因分布具有種族和地區(qū)差異性，各多態(tài)性位點(diǎn)在不同地域不同人群的基因頻率分布具有很大不同，亞洲人群和歐美人群分布并不一致，對于-786T/C的C等位基因以及4a4b的4a等位基因，在特定的人群如亞洲人群包括中國漢族人群可以認(rèn)為是CAD發(fā)病的風(fēng)險因素。值得注意的是，CAD存在臨床異質(zhì)性，早發(fā)CAD與遲發(fā)CAD在遺傳背景方面可能會存在一定差異[27]，這也可能對實(shí)驗(yàn)的抽樣帶來偏倚進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性。
　　關(guān)于eNOS基因多態(tài)性位點(diǎn)如何引起eNOS功能改變，終影響CAD的發(fā)生發(fā)展，目前尚未有明確結(jié)論。但有研究提示：-786T/C位點(diǎn)能夠顯著降低eNOS基因啟動子活性[12]，而4a4b位點(diǎn)也與血漿中NO水平的降低有明顯的關(guān)聯(lián)性[13]。這些結(jié)果表明：eNOS基因的這兩個與CAD發(fā)病相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)不僅是作為易患CAD的遺傳標(biāo)記出現(xiàn)，而且還可能通過影響eNOS蛋白的功能直接影響CAD的發(fā)生或病程。在后續(xù)研究中，筆者將加大樣本數(shù)，對樣本進(jìn)行臨床癥狀分型以分析特定基因型對于CAD的具體影響，并探討具體陽性位點(diǎn)與急性冠狀動脈綜合征、冠狀動脈狹窄嚴(yán)重程度以及冠狀動脈痙攣的關(guān)系[28-29]。同時還需在eNOS基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)和功能等方面進(jìn)行進(jìn)一步研究，深入闡釋eNOS基因多態(tài)性對CAD的作用和致病機(jī)制。
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