跨膜絲氨酸蛋白酶4對肝細(xì)胞癌增殖侵襲作用的影響

         跨膜絲氨酸蛋白酶4(transmembrane protease serine 4,TMPRSS4)是近來發(fā)現(xiàn)的11型跨膜絲氨酸蛋白酶家族(T丁sPs)的主要成員之一。TMPRSS4具有典型的絲氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)特征并具有胰蛋白酶活性m。目前已在包括胰腺癌、腸癌、肺癌、卵巢癌及甲狀腺癌等在內(nèi)的多種腫瘤組織都檢測TMPRSS4高表達(dá)。研究證實(shí)TMPRSS4是促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要分子1-3。目前國內(nèi)外尚無TMPRSS4在肝細(xì)胞癌(hepatoce11u1ar carcinoma,HCC')表達(dá)的研究。為此本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)探討了TMPRSS4表達(dá)對HCC增殖及侵襲的影口向。 
         材料與方法 
         1.實(shí)驗(yàn)材料:主要包括In-FusionT}PCR試劑盒(Clontech公司),Plasmid抽提試劑盒(Promega公司)、RT-PCR試劑盒(大連寶生物技術(shù)有限公司)、兔抗人TMPRSS4單克隆抗體(Protein Tech公司)、BCA蛋白濃度試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所),DMEM培養(yǎng)基(Gibcobrl公司),Transwell小室(Corning公司)、Matrigel膠(BD公司)全自動紫外可見分析裝置(FR-200A，復(fù)日公司)。 
         2.細(xì)胞培養(yǎng):采用肝細(xì)胞癌細(xì)胞株BEL-7402 0 DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，100 U/m}青霉素和100 Pg/ml鏈霉素)培養(yǎng).370C',50o CO孵育每3-}-4 d更換培養(yǎng)基。0.2500胰酶一乙二胺四乙酸<EDTA)消化后1，3傳代。 
         3.重組pGC-FU-TMPRSS4慢病毒載體的構(gòu)建:通過RT-PCR獲得特異性TMPRSS4基因片段，長度約493 by。膠回收純化后，將片段與載體相接。轉(zhuǎn)化后進(jìn)行酶切鑒定，約在500 by處可見特異性片段。測序后將所得序列在Blast上進(jìn)行比對，與原序列一致。將其連接在已酶切的pGC-FU(一)慢病毒上構(gòu)建pGC-FU-TMPRSS}慢病毒表達(dá)載體。細(xì)胞分為3組:正常BEL-7402對照組(control);空白載體對照組，即轉(zhuǎn)染空pGC-FU載體的BEL-7402細(xì)胞組(pGC-FU);TMPRSS4過表達(dá)組，即轉(zhuǎn)染pGC-FU-TMPRSS4載體的BEL-7402組(pGC-FU-TMPRSS4)。 
         4.RT-PCR檢測細(xì)胞丁MPRSS4mRNA表達(dá):細(xì)胞生長至亞融合狀態(tài)。PBS沖洗兩次。向收集有細(xì)胞沉淀的Eppendorf管中加人Trizol，按照說明書提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按試劑盒說明書操作，依次加人下列試劑(20川反應(yīng)體系):4瀏5}Primesc[x]riptT}`Buffer,1}d Primesc[x]riptTM RT Enzyme Mix,l Icl Oligo dT Primer<50 frmol/I)，1 f}l Random 6 mers(100}mol/I)，1;rg RNA，RNase Free dH}()補(bǔ)足至20川。PCR擴(kuò)增按照如下步驟進(jìn)行:預(yù)變性950C 15 min，變性94 0C 30、，退火60℃30 s，延伸72℃30 s，終末延伸72 0C 10 min。共35循環(huán)。TMPRSS4上游引物為5'-CCGATGTGT-TCAACTGGAAG-3'，下游引物為5'-CCCATC-CAATGATCCAGAGT-3'0(3-actin上游引物為J‘-UCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3'，下游引物為5'-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3'。 
         5.W estern blot檢測細(xì)胞TMPRSS4蛋白水平[ru:蛋白提取、定量并調(diào)整各組總蛋白含量相等，SDS-PAGE電泳和電轉(zhuǎn)移。用封閉液室溫下封閉轉(zhuǎn)移后的PVDF膜1h。將PVDF膜放人雜交袋中，加人一抗稀釋液稀釋的一抗，室溫?fù)u動反應(yīng)1 h,置4℃冰箱過夜。PI3ST洗滌PVDF膜3次，每次15 min。加人封閉液稀釋的二抗，室溫反應(yīng)30 min0 PBST洗滌PVDF膜4次，每次15 min0 ECL化學(xué)發(fā)光檢測:PVDF膜置于等量混合ECL中的A液和B液中，室溫孵育反應(yīng)3-}-5 min，暗室曝光顯影。 
         6.MTT實(shí)驗(yàn)按照實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行}'}:96孔板每孔加人100瀏2000個(gè)細(xì)胞.在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h。每孔加人10川CCK-8溶液。以加了細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加人細(xì)胞的孔作為空白對照。在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2h。在450 nm測定吸光度，根據(jù)吸光度計(jì)算細(xì)胞相對數(shù)量及增殖率。 
         7.侵襲實(shí)驗(yàn):Matrigel膠a 0c過夜解凍后用無血清預(yù)冷的DMEM按1，8稀釋。將100川稀釋過的Matrigcl膠加人Transwell小室上室，37℃孵育2-}-3}:使其成凝膠狀0.2500胰酶-EDTA消化細(xì)胞并用不含血清的DMEM重懸細(xì)胞，使其濃度為10'一m1在Matrigel膠上加人100川細(xì)胞懸液·下室加人600川條件培養(yǎng)液。37 0C,50o CO:培養(yǎng)24 h后取出小室棉簽擦凈膜上未侵襲的細(xì)胞及Matrigcl膠。37℃預(yù)溫的PhS漂洗，甲醇固定.Giemsa染液染色。切下膜固封于載玻片上，200倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，取平均值。每個(gè)不同條件的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 
         8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x.士、)。組間比較采用t檢驗(yàn)，頻數(shù)變量之間比較用丫檢驗(yàn)。 
         結(jié)果

         1.過表達(dá)TMPRSS4慢病毒轉(zhuǎn)染人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株BEI=7402 24 h后，在熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染成功的TMPRSS4過表達(dá)BEL-7402細(xì)胞(圖la)及轉(zhuǎn)染空白載體的BEL-7402細(xì)胞(圖1b>發(fā)出綠色熒光，而對照組BEL-7402細(xì)胞無綠色熒光(圖lc)

         2.RT-PCR結(jié)果顯示，慢病毒轉(zhuǎn)染后，pGC-FU-TMPRSS4組細(xì)胞TMPRSS4 mRNA表達(dá)增強(qiáng)(圖2),TMPRSS4條帶光密度較對照組和pGC-FU組明顯增強(qiáng)((1.340士0.198,P}0.05)，而對照組和pGC-FU組中的條帶光密度無明顯差異(0.363士0.182比0.365士0.171,P}0.05)。說明人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株BEL-7402轉(zhuǎn)染目的基因TMPRSS4成功。 
         3.Western blo、結(jié)果顯示，與對照組和pGC-FU組比較，pGC-FU-TMPRSS4組細(xì)胞TMPRSS4蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，而對照組與pC}C:-FU組TMPRSS4蛋白表達(dá)無明顯差異(圖3)。結(jié)果進(jìn)一步說明BEL-7402細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染并表達(dá)目的基因TMPRSS4。 
         4.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢病毒轉(zhuǎn)染后，對照組，pGC-FU組和pGC-FU-TMPRSS4組細(xì)胞增殖能力無顯著差異(圖4,P}0.05)。說明TMPRSS4過表達(dá)對BE工一7402細(xì)胞株的增殖無顯著影響。 
         5.侵襲實(shí)驗(yàn)顯示pUC-FU-TMPRSS4組細(xì)胞穿過Matrigel膠到達(dá)Transwell小室膜背面的細(xì)胞數(shù)為49.3士7.4，顯著高于對照組(23.3士5.時(shí)和pGC-FU組(19.3}-3.2)(P}0.05)。提示TMPRSS4過表達(dá)后細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)。 
       

         討論

         蛋自酶在腫瘤演進(jìn)中的作用日益受到重視。蛋白酶失調(diào)導(dǎo)致的蛋白水解是腫瘤演進(jìn)的標(biāo)志之一，而蛋白酶降解細(xì)胞基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)則是腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲過程中必不可少的環(huán)節(jié)。在這一過程中起主要作用的是金屬蛋白酶家族(MMPs)和絲氨酸蛋白酶家族。MMPs家族在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用已被廣泛認(rèn)識。但是，絲氨酸蛋白酶家族，尤其n型跨膜絲氨酸蛋白酶(I`TSPs)在腫瘤進(jìn)展中的作用尚未完全揭示。TMPRSS4是近發(fā)現(xiàn)的TTSP、家族中的主要成員之一。其多膚序列包括437個(gè)氨基酸，具有典型的絲氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)特征并具有胰蛋白酶活性。TMPRSS4首先于2000年被發(fā)現(xiàn)在胰腺癌組織內(nèi)高表達(dá)。此后，在多種腫瘤組織都檢測到高表達(dá)，并與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)1污我們通過構(gòu)建TMPRSS4過表達(dá)慢病毒載體并轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞株，建立了可穩(wěn)定傳代的過表達(dá)TMPRSS4的IICC細(xì)胞株。我們采用RT-PCR及Western blot檢測了對照組、空白載體轉(zhuǎn)染組和TMPRSS4過表達(dá)組HCC細(xì)胞TMPRSS4 mRNA及蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示盡管對照組及空白載體轉(zhuǎn)染組H CC_'細(xì)胞TMPRSS4表達(dá)明顯低于TMPRSS4過表達(dá)組細(xì)胞，但是仍可檢測到TMPRSS4的表達(dá)。盡管實(shí)驗(yàn)顯示‘hMPRSS4表達(dá)對HCC細(xì)胞的增殖并無顯著影響，但是我們發(fā)現(xiàn)TMPRSS4過表達(dá)組HCC細(xì)胞侵襲性顯著強(qiáng)于對照組及空白載體轉(zhuǎn)染組HCC細(xì)胞的侵襲性。 
         這一結(jié)果說明TMPRSS4是調(diào)控HCC細(xì)胞侵襲性的重要基因之一。研究顯示TMPRSS4可通過誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)而促進(jìn)腫瘤的侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移困。EMT是指上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的復(fù)雜過程。在此過程中上皮細(xì)胞的極性消失，遷移和運(yùn)動能力增強(qiáng)，同時(shí)伴有上皮細(xì)胞的標(biāo)志丟失，而間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志過度表達(dá)川。EMT是目前上皮來源的惡性腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要原因叫。近年的研究發(fā)現(xiàn)在肝癌的發(fā)生及進(jìn)展中存在EMT現(xiàn)象，并且與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)u}z}。我們的前期研究顯示，肝癌TMPRSS4過度表達(dá)，可抑制E-cadherin的表達(dá)及促進(jìn)N-cadher-in和Vimentin的表達(dá)，從而導(dǎo)致肝癌EMT的發(fā)生。但是，TMPRSS4誘導(dǎo)肝癌EMT發(fā)生的相關(guān)信號通路及調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚不清楚。為此，仍需進(jìn)一步明確TMPRSS4誘導(dǎo)EMT及促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，以期找到新的抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)，從而提高肝癌的療效。 
         參考文獻(xiàn) 
         [1]Wallrapp C,H(a)hnel S,M(u)ller-Pillasch F.A novel trans membrane serine protease(TMPRSS3)overexpressed in pancreatic cancer[J].Cancer Research,2000.2602-2606.

         [2]Kebebew E,Peng M,Reiff E.ECM1 and TMPRSS4 are diagnostic markers of malignant thyroid neoplasms and improve the accuracy of fine needle aspiration biopsy[J].Annals of Surgery,2005.353-361.

         [3]Sawasaki T,Shigemasa K,Gu L.The transmembrane protease serine(TMPRSS3/TADG-12)D variant:a potential candidate for diagnosis and therapeutic intervention in ovarian cancer[J].Tumor Biology,2004.141-148.

         [4]李濤,薛瓊,周健煒.綠膿桿菌制劑抑制肝細(xì)胞肝癌生長轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華肝膽外科雜志,2009,(11):848-850.doi:10.3760/cma.j.issn.1007-8118.2009.11.016.

         [5]李濤,智緒亭,周建煒.小劑量阿司匹林協(xié)同干擾素-a抑制肝細(xì)胞肝癌生長轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華肝膽外科雜志,2012,(1):50-54.doi:10.3760/cma.j.issn.1007-8118.2012.01.015.

         [6]Jung H,Lee KP,Park SJ.TMPRSS4 promotes invasion,migration and me[x]tastasis of human tumor cells by facilitating an epithelial-mesenchymal transition[J].Oncogene,2008,(18):2635-2647.doi:10.1038/sj.onc.1210914.

         [7]Funasaka T,Hu H,Yanagawa T.Down-regulation of phosphoglucose isomerase/autocrine motility factor results in mesenchymal-to-epithelial transition of human lung fibrosarcoma cells[J].Cancer Research,2007.4236-4243.

         [8]Huang HC,Hu CH,Tang MC.Thymosin beta4 triggers an epithelial-mesenchymal transition in colorectal carcinoma by upregulating integrin-li[x]nked kinase[J].Oncogene,2007,(19):2781-2790.doi:10.1038/sj.onc.1210078.

         [9]Park MY,Kim KR,Park HS.ex[x]pression of the serum response factor in hepatocellular carcinoma:implications for epithelial-mesenchymal transition[J].International Journal of Oncology,2007.1309-1315.

         [10]Lee TK,Man K,Poon RT.Signal transducers and activators of transc[x]ription 5b activation enhances hepatocellular carcinoma aggressiveness through induction of epithelial-mesenchymal transition[J].Cancer Research,2006.9948-9956.