發(fā)現(xiàn)抑制乙肝表面抗原分泌的新策略

乙肝病毒感染引起的慢性乙型肝炎仍是我國主要的感染性疾病，乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)在慢性乙型肝炎的致病過程中起重要作用。病人血液中高達300μg/ml的HBsAg除了吸附特異性的中和性抗體，還損害人體針對乙肝病毒的免疫反應；經(jīng)過一段時間的治療促使病人外周血HBsAg持續(xù)性消失被認為是慢性乙肝功能性治的主要標志，其目的是降低慢性乙肝病人發(fā)生肝硬化和肝癌的風險。但是目前的藥物治療極少達到HBsAg持續(xù)性消失。

已有報道，采用HBsAg特異性抗體和HBV疫苗接種或抗病毒藥物的聯(lián)合治療措施可使慢性乙肝病人HBsAg持續(xù)消失的比例提高。HBsAg特異性抗體的抗病毒效應的機制包括：中和外周血中的游離病毒以防止感染新的肝細胞從而抑制cccDNA池擴增；抗體Fc介導的效應機制；肝細胞內吞抗體抑制HBsAg分泌。內吞的抗體可在細胞內吞體或其它細胞腔室與HBsAg結合形成免疫復合物，并抑制HBsAg分泌。盡管免疫復合物累積在肝細胞內但并未觀察到肝臟損傷和其它副作用。目前需要頻繁靜脈注射HBsAg特異性抗體才能維持有效的血漿濃度，但也降低了病人治療的依從性。一旦停止抗體治療，病人血漿HBsAg和病毒DNA載量經(jīng)常反彈至治療前的水平，而且HBsAg特異性抗體制備仍然繁瑣而且昂貴。

單鏈抗體(single chain variable fragment, scFv)是將抗體輕、重鏈可變區(qū)通過一段柔性多肽連接而成的重組蛋白，具有與親本抗體相似的抗原結合特異性，但它的分子量更小(約30kDa)。將scFv與鉸鏈區(qū)(hinge domain, HD)、跨膜結構域(transmembrane domain, TMD)及一個或多個細胞內結構域串聯(lián)可形成嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)。表達CAR的T細胞(CAR-T)可不依賴主要組織相容復合物(major histocompatibility complex)識別和殺傷腫瘤細胞，在治療血液腫瘤上已顯示具有療效。

課題組前期制備了高親和力結合包膜蛋白抗原環(huán)(antigenic loop, AGL)的G12-scFv(解離常數(shù)為1.77×10-10M)，并發(fā)現(xiàn)外源G12-scFv可被肝細胞內吞而選擇性抑制病毒體分泌(Antiviral Research, 2019, 162: 118-129; Nature Communications, 2022, 13: 4614)，這可能由于在細胞晚期內吞體內G12-scFv與病毒體結合所致。因此，推測內源性表達的G12-scFv或靶向PreS1的MA18/7-scFv可能有效地抑制病毒體或亞病毒顆粒(subviral particle, SVP)分泌。為驗證這一假設，應用分泌信號肽將內源表達的G12-scFv或MA18/7-scFv及其CAR或與Fc融合的衍生物轉位至內質網(wǎng)和分泌通路，在表達HBV的肝癌細胞系和小鼠模型中評價它們對HBsAg分泌的效應。結果顯示G12-CAR能夠有效阻止病毒體和亞病毒顆粒分泌，但并不引起細胞內cccDNA擴增；MA18/7-scFv及其CAR還能有效阻止HBV感染肝細胞。在HBV小鼠模型中，F(xiàn)c融合的G12-scFv和G12-CAR能強烈抑制血清HBsAg(抑制效率高達130倍)；通過AAV載體表達可使抑制效應持續(xù)8周以上。深入研究發(fā)現(xiàn)，G12-scFv和G12-CAR能使包膜蛋白截留在內質網(wǎng)而阻止HBV出芽（圖一），而且這些免疫復合物并不引起細胞毒性和肝臟損傷。上述結果表明，F(xiàn)c融合的G12-scFv和G12-CAR代表了一種有效降低外周血HBsAg的新方法。此外，這項工作也提示CAR除了應用于T細胞治療以外，還具有直接抗病毒活性；通過內源表達靶向包膜蛋白的CAR或scFv可用于預防其它包膜病毒感染或通過抑制病毒釋放而阻止傳播。