mRNA Display技術(shù)，探索蛋白類藥物研發(fā)新前沿

在分子生物學(xué)的世界里，科學(xué)家們一直在尋找新的方法來研究蛋白質(zhì)與RNA之間的相互作用。這些相互作用對于理解細(xì)胞內(nèi)的許多生物過程至關(guān)重要，包括基因表達(dá)、蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞信號傳導(dǎo)。近年來，mRNA展示技術(shù)(mRNA Display)引起了廣泛關(guān)注，它為科學(xué)家們提供了一種強(qiáng)大的工具來探索這些復(fù)雜的分子間關(guān)系。mRNA展示技術(shù)是一種新興且強(qiáng)大的體外多肽篩選技術(shù)，其核心是借助嘌呤霉素形成mRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，將多肽表型篩選與基因型直接聯(lián)系起來，廣泛應(yīng)用于高親和力結(jié)合肽的篩選。本文將深度解析mRNA展示技術(shù)這一創(chuàng)新篩選技術(shù)的工作原理與優(yōu)勢，揭示這一前沿技術(shù)如何助力多肽及蛋白類藥物的篩選與發(fā)現(xiàn)。

什么是mRNA展示技術(shù)？

mRNA展示技術(shù)又稱mRNA-蛋白質(zhì)融合體展示技術(shù)，是將基因型(mRNA)與表型(多肽/蛋白)融合的體外多肽/蛋白篩選技術(shù)，將肽與其編碼mRNA進(jìn)行共價連接，使用嘌呤霉素作為連接物?？捎糜谏锓肿优潴w的發(fā)現(xiàn)和相互作用分析。

mRNA展示庫的構(gòu)建

? DNA庫制備：使用分子生物學(xué)技術(shù)制備DNA庫(通常為編碼約4~14個氨基酸的環(huán)肽)；

? DNA庫的體外轉(zhuǎn)錄：通過RNA聚合酶的作用，DNA庫被轉(zhuǎn)錄成mRNA；

? 嘌呤霉素連接：嘌呤霉素分子通過DNA連接子序列連接到每個mRNA上，嘌呤霉素是一種抗生素，作為氨基酰化的tRNA類似物(tRNA在翻譯過程中向核糖體傳遞氨基酸)，并作為mRNA和肽之間的連接子；

? mRNA庫的體外翻譯：mRNA-嘌呤霉素偶聯(lián)物進(jìn)行體外翻譯，由核糖體翻譯生成相應(yīng)的肽；

? 線性肽的環(huán)化修飾：通過化學(xué)合成技術(shù)進(jìn)行環(huán)化修飾；

? 逆轉(zhuǎn)錄：mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成mRNA-cDNA雙鏈，產(chǎn)生mRNA/cDNA-嘌呤霉素-肽偶聯(lián)物庫；

? 孵育與洗滌：將mRNA-cDNA-肽融合庫與固定在固體載體上的靶蛋白一起孵育，然后進(jìn)行洗滌以去除未結(jié)合的肽；

? 擴(kuò)增、富集與測序：結(jié)合肽的cDNA通過PCR擴(kuò)增，然后用作DNA庫模板，在進(jìn)一步的重復(fù)幾輪mRNA展示庫篩選中，富集與靶蛋白高親和力的結(jié)合肽，通過cDNA的測序來確定多肽的結(jié)構(gòu)。

?體外篩選:整個過程均在體外進(jìn)行，無需依靠細(xì)胞

技術(shù)亮點(diǎn)一

通過嘌呤霉素形成mRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物

嘌呤霉素為一種蛋白質(zhì)合成抑制劑，由于具有與酪氨酰-tRNA末端相似的結(jié)構(gòu)，因此能與氨基酸結(jié)合。通過寡核苷酸連接子將嘌呤霉素與mRNA的3'端連接，通過核糖體的體外翻譯作用，以帶有嘌呤霉素的mRNA為模板，在重組元件蛋白合成(PURE)翻譯系統(tǒng)中翻譯成新生肽鏈。

技術(shù)亮點(diǎn)二

體外遺傳密碼重編程技術(shù)

引入非典型氨基酸：

? mRNA-嘌呤霉素偶聯(lián)物進(jìn)行體外翻譯中，可以使用細(xì)胞裂解液或單獨(dú)純化的各組分的重組混合物進(jìn)行，例如使用重組元件蛋白合成(PURE)翻譯系統(tǒng)；

? PURE翻譯系統(tǒng)允許對翻譯所需的成分進(jìn)行完全控制，包括氨基酸、氨酰tRNA合成酶(aaRS)、tRNA和翻譯因子，允許遺漏和/或替代各種組分。

利用重組元件蛋白合成(PURE)翻譯系統(tǒng)：

? 對于底物為接近天然氨基酸的類似物，可以簡單地用非蛋白氨基酸替代天然氨基酸；

? Flexible in vitro translation (FIT)的方法：利用Flexizyme催化制備攜帶非蛋白類氨基酸(nAA)的tRNA，并將其引入PURE系統(tǒng)，替代天然氨基酸及其相應(yīng)的tRNA，并將相應(yīng)非蛋白氨基酸結(jié)合在合適的密碼子處。

技術(shù)亮點(diǎn)三

mRNA展示肽庫的環(huán)化修飾

基于二氨基酰戊二酸的環(huán)化：

Roberts組報道了一種采用經(jīng)典的二氨基酰戊二酸連接子的方法，將肽的N端氨基與下游賴氨酸殘基的側(cè)鏈氨基連接，在N端和賴氨酸殘基之間包含有2至10個殘基的可變區(qū)域

基于二溴二甲苯的環(huán)化修飾：

Szostak組報道了一種將兩個半胱氨酸殘基通過間位取代的二溴二甲苯連接的環(huán)化修飾方法，生成由不可還原的硫醚鍵環(huán)化的大環(huán)肽庫

基于羊毛硫肽的環(huán)化修飾：

Szostak組報道了另一種基于羊毛硫肽化合物(Lanthipeptides)的環(huán)化修飾：

? Lanthipeptides是由核糖體合成并經(jīng)翻譯后修飾的肽，其特征是羊毛硫氨酸(lanthionine)部分的存在

? 該方法是通過在PURE系統(tǒng)中采用4-硒賴氨酸取代賴氨酸，mRNA展示庫首先用谷胱甘肽二硫化物處理，來保護(hù)半胱氨酸殘基，然后，用過氧化氫溶液誘導(dǎo)4-硒賴氨酸氧化消除，生成脫氫丙氨酸殘基。用TCEP還原二硫化物，引發(fā)了分子內(nèi)對脫氫丙氨酸的1,4加成，而形成硫氨酸部分

基于N-氯乙酰氨基酸的環(huán)化：

HiroakiSuga組報道了一種通過體外翻譯生成大環(huán)骨架的新方法：

? 位于起始位置的N-氯乙酰氨基酸與下游半胱氨酸殘基的側(cè)鏈硫醇反應(yīng)，形成硫醚橋，該反應(yīng)在翻譯步驟后自發(fā)發(fā)生，不需要額外的連接試劑。

? 利用Flexizyme催化tRNA氨基?；倪z傳密碼重編程，在體外翻譯系統(tǒng)中安裝N-氯乙酰氨基酸

雙環(huán)肽環(huán)化修飾庫：

HiroakiSuga組報道了兩種正交環(huán)化化學(xué)(Cu催化疊氮-炔環(huán)加成和硫醚環(huán)化)方法，通過核糖體合成產(chǎn)生雙環(huán)肽，Hartman組的一項相關(guān)研究，將雙環(huán)肽修飾技術(shù)應(yīng)用到了mRNA展示庫中：

? 兩個半胱氨酸殘基首先與間二溴二甲苯連接，然后通過Cu催化的疊氮-炔環(huán)加成，在β-疊氮高丙氨酸和對乙炔基苯基丙氨酸殘基之間形成三唑環(huán)，其在體外翻譯中分別替代自甲硫氨酸和苯丙氨酸

? 通過移動一個半胱氨酸和乙炔基殘基的位置，得到不同大小的雙環(huán)肽庫

mRNA展示技術(shù)的優(yōu)勢

mRNA展示技術(shù)屬于體外展示技術(shù)，與包括噬菌體展示技術(shù)在內(nèi)的體內(nèi)展示技術(shù)相比，具有多種優(yōu)勢，主要體現(xiàn)在更大的化合物庫容量、化合物多樣性、篩選過程和實驗周期等。

mRNA展示技術(shù)的優(yōu)勢：

? 更大的化合物庫容量：與噬菌體展示技術(shù)相比，mRNA展示技術(shù)使用體外轉(zhuǎn)錄和翻譯(IVTT)，避免了對大腸桿菌轉(zhuǎn)染的需要(而這限制了噬菌體展示庫的大小在~108個序列)，mRNA展示技術(shù)可以制備更大的化合物庫(1012~13個序列)

? 化合物多樣性：可構(gòu)建引入多種非天然氨基酸的肽庫

? 篩選過程中的反應(yīng)條件：整個過程在無細(xì)胞條件下進(jìn)行；可完全控制篩選的條件

? 實驗周期：篩選測序周期更短，mRNA展示技術(shù)篩選+多肽測序周期2~3周，而噬菌體展示需要6~8周。

總之，mRNA展示技術(shù)由于其突出的優(yōu)勢擁有廣泛的應(yīng)用場景。

案例分享

2021年荷蘭Leiden大學(xué)Martin教授組通過mRNA展示技術(shù)篩選并合成了多個煙酰胺 N-甲基轉(zhuǎn)移酶（NNMT）非競爭性多肽抑制劑。NNMT 使用 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體，將煙酰胺甲基化形成1-甲基煙酰胺（MNA）。NNMT是包括癌癥、糖尿病和肥胖在內(nèi)的多種疾病的潛在治療靶點(diǎn)。

Martin組通過 mRNA 展示篩選技術(shù)篩選的幾種環(huán)肽顯示出對 NNMT 的有效抑制，IC50值低至229 nM。還發(fā)現(xiàn)這些肽在細(xì)胞測定中下調(diào) MNA 的產(chǎn)生。有趣的是，底物競爭實驗表明，這些環(huán)肽抑制劑與 SAM 或 NA 無關(guān)，表明它們可能是第一個報道的 NNMT 變構(gòu)抑制劑。

總結(jié)與展望

mRNA展示技術(shù)作為一種新興的體外篩選多肽和蛋白質(zhì)的有力工具，通過mRNA與翻譯出的多肽或蛋白質(zhì)共價結(jié)合，形成mRNA-多肽/蛋白質(zhì)融合體，能在大容量的多肽化合物庫中篩選具有特定生物學(xué)功能的多肽或蛋白質(zhì)。mRNA展示技術(shù)解決了噬菌體展示、酵母表面展示等展示技術(shù)面臨的多數(shù)困難，有利于構(gòu)建更加多樣化的化合物庫，有助于蛋白質(zhì)體外篩選技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。