hURAT1基因3′非編碼區(qū)SNP篩查及與原發(fā)性高尿酸血癥的關(guān)系

    作者：呂森森,吳秀英,韓琳,王瑤,李長(zhǎng)貴　　作者單位：青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 青島 266003

　　【摘要】目的在人尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(hURAT1)基因3′非編碼區(qū)(3′UTR區(qū))篩查與原發(fā)性高尿酸血癥關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。方法 對(duì)原發(fā)性高尿酸血癥病人273例、健康體檢者429例(正常對(duì)照組)，采用酚-氯仿法提取外周血白細(xì)胞基因組DNA，特異性引物擴(kuò)增3′UTR區(qū)，并進(jìn)行基因測(cè)序，對(duì)基因型及頻率進(jìn)行分析。結(jié)果 共檢測(cè)到3種SNP，分別為1925 G>A、del G 1951及G 2174 A，上述SNP位點(diǎn)所組成的基因型頻率在高尿酸血癥病人組和正常對(duì)照組差異無(wú)顯著性。2例原發(fā)性高尿酸血癥病人hURAT1基因3′UTR區(qū)第1827-1828位2個(gè)堿基缺失(del TC 1827-1828)，這2例病人的血尿酸水平明顯高于其他病人，正常對(duì)照組未檢測(cè)到該缺失。結(jié)論 3′UTR區(qū)存在3個(gè)SNP位點(diǎn),其中del TC 1827-1828位點(diǎn)可能是原發(fā)性高尿酸血癥致病位點(diǎn)。

　　【關(guān)鍵詞】 高尿酸血癥;人尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1;基因型;基因頻率;單核苷酸多態(tài)性

　　POLYMORPHISMS IN 3′-UNTRANSLATED REGION OF URATE TRANSPORTOR 1 RELATED TO HYPERURICEMIA　　L SEN-SEN, WU XIU-YING, HAN LIN, et al　　Department of Endocrinology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China

　　[ABSTRACT]ob[x]jective To find new single nucleotide polymorphisms (SNP) in 3′-untranslated region (3′UTR) of urat1 related to primary hyperuricemia.Methods　This study consisted of 273 patients with primary hyperuricemia (PH), and 429 healthy volunteers. DNA was purified from peripheral blood and 3′UTR of the URAT1 gene was sequenced. The genotype and its frequencies were analyzed.Results Three kinds of SNP were found: 1925 G>A, del G 1951 and G 2174 A. The differences of genotype frequencies between the groups were not significant. The del TC 1827-1828 was absent in two patients, but no absence observed in healthy volunteers. These two patients showed a higher serum uric acid (573 μmol/L,630 μmol/L VS 499.69±136.08 μmol/L) than the rest in the same group. Conclusion Three SNP sites were detected in 3′UTR region, in which, the del TC 1827-1828 is likely to be the pathogenic site of hyperuricemia.

　　[KEY WORDS]Hyperuricemia; Human urate transportor 1; Genotype; Gene Frequency; Single nucleotide polymorphism

　　人尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(hURAT1)是位于近端腎小管上皮細(xì)胞特異表達(dá)的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是維持血尿酸水平的關(guān)鍵離子通道，是原發(fā)性高尿酸血癥的重要候選基因。國(guó)內(nèi)外以及我們課題組的研究結(jié)果表明，該基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)和突變與血尿酸水平密切相關(guān)[1～9]。目前發(fā)現(xiàn)的SNP和突變位點(diǎn)主要位于hURAT1基因的外顯子、內(nèi)含子和啟動(dòng)子區(qū)域，在3′非編碼區(qū)(3′UTR區(qū))尚未發(fā)現(xiàn)與原發(fā)性高尿酸血癥密切相關(guān)的SNP位點(diǎn)。3′UTR 在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用[10～13]。3′UTR的基因變異雖然不直接改變hURAT1基因的編碼序列，但可引起hURAT1基因功能的改變。原發(fā)性高尿酸血癥是多基因遺傳性疾病。同一基因不同位點(diǎn)的SNP和突變均可參與原發(fā)性高尿酸血癥的發(fā)病。本研究對(duì)273例原發(fā)性高尿酸血癥病人和429例正常體檢者h(yuǎn)URAT1基因3′UTR區(qū)SNP和突變位點(diǎn)進(jìn)行篩查，以期發(fā)現(xiàn)與原發(fā)性高尿酸血癥相關(guān)的SNP或突變位點(diǎn)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

　　1 對(duì)象和方法

　　1.1 研究對(duì)象

　　原發(fā)性高尿酸血癥病人(病人組)273例，男228例，女45例;年齡16～85歲，平均(49.88±15.06)歲。病人均來(lái)自青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科病房和門(mén)診。原發(fā)性高尿酸血癥診斷參照第6版《內(nèi)科學(xué)》教材，即絕經(jīng)前女性尿酸>350 μmol/L，男性和絕經(jīng)后女性尿酸>420 μmol/L。排除因腎臟、肝臟、心臟、血液病及藥物等引起的繼發(fā)性高尿酸血癥。選取同期健康體檢者429例作為正常對(duì)照組，其中男224例，女205例;年齡20～86歲，平均(42.98±13.67)歲。所有研究對(duì)象均無(wú)高尿酸血癥或痛風(fēng)病史及家族史，無(wú)心臟、腎臟、肝臟等器質(zhì)性疾病。

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 外周血DNA抽提

　　酚-氯仿法抽提外周血白細(xì)胞基因組DNA。用紅細(xì)胞、白細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞和白細(xì)胞，加入蛋白酶K后45 ℃消化過(guò)夜。次日加入等體積新配制的苯酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)混合液，抽提DNA。雙蒸水溶解至50 mg/L備用。

　　1.2.2 目的片段的擴(kuò)增和基因型分析

　　多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增URAT1基因的3′UTR，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 1 112 bp,上游引物5′-TGGCATTCCCTG-GAGTCCTT-3′，下游引物5′-CACAACAGGCGCT-GGAAAC-3′。 20 μL反應(yīng)體系包括：10×Taq reaction Buffer 2 μL，25 mol/L MgCl2 1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1 μL，2 μmol/L上下游引物各1 μL，50 mg/L DNA稀釋液 1 μL，2.5×106U/L Taq DNA Polymerase 0.5 μL，用去離子三蒸水補(bǔ)齊至20 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min，然后94 ℃變性40 s、66 ℃退火40 s、72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳，確定擴(kuò)增片段為所需目的片段。將PCR產(chǎn)物純化，根據(jù)Sanger雙脫氧鏈終止法原理測(cè)序。測(cè)序引物分別是5′-GAGTCCTTGGGATGGACACA-3′,5′-CTTGCCAACCCTCTGCTT-3′。

　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

　　正態(tài)分布計(jì)量資料用x±s表示，數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)。用Hardy-Weinberg檢驗(yàn)確認(rèn)標(biāo)本的群體代表性。采用PPMS 1.5[14]統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。

　　2 結(jié)果

　　2.1 兩組生化資料的比較

　　原發(fā)性高尿酸血癥病人組三酰甘油(TG)、尿酸、尿素氮(BUN)明顯高于正常對(duì)照組，差異具有顯著性(t=5.639～23.210,P<0.001)。見(jiàn)表1。表1 正常對(duì)照組與病人組生化資料比較(略)

　　2.2 各SNP位點(diǎn)的Hardy-Weinberg 遺傳平衡分析及基因型與原發(fā)性高尿酸血癥的相關(guān)性

　　對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行遺傳平衡分析顯示，正常對(duì)照組與病人組標(biāo)本代表性較好(χ2=0.17～0.36,P>0.05)。共檢測(cè)到3種SNP，分別為1925 G>A、del G 1951及G 2174 A，上述SNP位點(diǎn)所組成的基因型頻率在高尿酸血癥病人組和正常對(duì)照組差異無(wú)顯著性(χ2=2.55、1.33、0.93,OR=1.71、0.84、0.86,P>0.05)。見(jiàn)表2。2例原發(fā)性高尿酸血癥病人hURAT1基因3′UTR區(qū)第1827-1828位2個(gè)堿基缺失(del TC 1827-1828)，這2例病人的血尿酸水平明顯高于其他病人，正常對(duì)照組未檢測(cè)到該缺失。表2 Hardy-Weinberg遺傳平衡、基因型與疾病相關(guān)性分析(略)

　　2.3 兩組間單倍型頻率比較

　　本文3個(gè)SNP位點(diǎn)主要形成5種單倍型，正常對(duì)照組和病人組單倍型頻率差異無(wú)顯著意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。表3 兩組單倍型頻率比較(略)

　　3 討 論

　　hURAT1是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的維持血尿酸水平的關(guān)鍵離子通道，hURAT1基因的異常表達(dá)可直接導(dǎo)致低尿酸或高尿酸血癥[1～9]。GRAESSLER等[3]研究顯示，hURAT1基因第2外顯子C426T多態(tài)性與德國(guó)人群腎尿酸排泄減少和高尿酸血癥顯著相關(guān)，相對(duì)于CC基因型，CT和TT基因型個(gè)體腎臟排泄分?jǐn)?shù)明顯降低，血尿酸水平明顯升高。YUKIO等[4]研究顯示，日本男性受試者中hURAT1第4內(nèi)含子G/T多態(tài)不同基因型者(GG、GT和TT)血尿酸水平明顯不同，GG基因型者血尿酸水平高，GT基因型者次之，TT基因型者低，提出在日本人群中，該SNP位點(diǎn)可作為獨(dú)立的高尿酸血癥預(yù)測(cè)標(biāo)記。VA ZQUEZ-MELLADO等[5]對(duì)墨西哥原發(fā)性痛風(fēng)病人及一級(jí)家屬和120名健康個(gè)體的hURAT1基因序列分析結(jié)果顯示，69例原發(fā)性痛風(fēng)病人中16例存在hURAT1基因突變，占病人的23%，其中5種突變位于第5 外顯子，1種突變位于第4外顯子，提出上述突變可能與原發(fā)性高尿酸血癥有關(guān)。提示hURAT1基因SNP或突變與原發(fā)性高尿酸血癥密切相關(guān)。

　　人類(lèi)基因的轉(zhuǎn)錄翻譯是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過(guò)程。 hURAT1基因3′UTR區(qū)SNP和基因突變可導(dǎo)致該基因功能的改變，是原發(fā)性低尿酸血癥發(fā)病的重要原因。ANZAI等[6]的研究顯示，日本人群hURAT1基因3′UTR區(qū)存在del GTCCT 1639-1643 [rs61157735(-/GCCCT)]多態(tài)，該多態(tài)導(dǎo)致腎性低尿酸血癥。GRAESSLER等[5]研究顯示，德國(guó)原發(fā)性高尿酸血癥病人URAT1基因的3′UTR存在1703-1705 位CCT堿基的缺失。本研究在正常人群和原發(fā)性高尿酸血癥病人中均未發(fā)現(xiàn)上述多態(tài)性位點(diǎn)和堿基缺失, 說(shuō)明3′UTR的SNP和突變存在種族差異。

　　本研究結(jié)果顯示，hURAT1基因3′UTR存在3個(gè)SNP位點(diǎn)：1925 G>A、del G 1951(rs11287614)及G 2174 A，和一個(gè)突變位點(diǎn)del TC 1827-1828。其中1925 G>A和G 2174 A是國(guó)際上在該區(qū)域發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)，雖然這2個(gè)SNP位點(diǎn)在正常人群和原發(fā)性高尿酸血癥人群中均出現(xiàn)且基因型頻率差異無(wú)顯著性，但由于在其他種族中均未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的存在，且在中國(guó)人群中出現(xiàn)頻率較高，提示這2個(gè)SNP位點(diǎn)可能是遺傳標(biāo)記。

　　本研究顯示，3′UTR 區(qū)尚存在1827-1828位TC堿基的缺失，由于該缺失只在原發(fā)性高尿酸血癥病人中出現(xiàn)，在429例正常人群中無(wú)此缺失，因此該缺失為突變。對(duì)突變攜帶者進(jìn)一步研究顯示，突變攜帶者血尿酸水平明顯高于病人組其他病人，提示del TC 1827-1828可能與原發(fā)性高尿酸血癥有關(guān)。該點(diǎn)突變可能通過(guò)下列機(jī)制導(dǎo)致高尿酸血癥：①堿基缺失引起3′UTR端閱讀框架發(fā)生改變，轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)或剪切位點(diǎn)發(fā)生改變;②抑制局部micro RNA形成，使基因轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng);③TC 堿基缺失后，polyA長(zhǎng)度改變，增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄翻譯效率。轉(zhuǎn)錄翻譯后URAT1基因表達(dá)增強(qiáng)，對(duì)尿酸的重吸收增多，導(dǎo)致高尿酸血癥。由于該點(diǎn)突變只在2例原發(fā)性高尿酸血癥的病人中檢出，檢出率僅為0.733%，提示該點(diǎn)突變雖然可能與原發(fā)性高尿酸血癥有關(guān)，但不是導(dǎo)致原發(fā)性高尿酸血癥的主要原因。

　　綜上所述，中國(guó)山東沿海地區(qū)人群hURAT1基因的3′UTR存在3個(gè)SNP位點(diǎn)，與原發(fā)性高尿酸血癥的關(guān)聯(lián)不明顯，可作為中國(guó)山東沿海地區(qū)人群正?；蚪M遺傳標(biāo)記;1827-1828位TC堿基的缺失可能與原發(fā)性高尿酸血癥相關(guān)，需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行篩查，并通過(guò)功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)該堿基的缺失是否與hURAT1基因的高表達(dá)有關(guān)。

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