結(jié)核桿菌PEPCK免疫作用的初步研究

　作者：柏雪蓮,王志強(qiáng),刁興華,張珍,劉春會　　作者單位：1 濱州醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室 濱州市 256603;2 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院
　　【摘要】目的 初步研究結(jié)核桿菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶(PEPCK)的免疫作用。方法 用敲除pckA基因的卡介苗(BCG△pckA)和野生型卡介苗(BCGWT)分別感染小鼠，取肺臟進(jìn)行病理分析;取脾臟用流式細(xì)胞儀檢測CD4+ 、CD8+T細(xì)胞、CD4+/CD8+，酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測IL12;取脾臟進(jìn)行結(jié)核桿菌的培養(yǎng)，比較兩組菌落數(shù)量。結(jié)果 BCG△pckA感染的小鼠比BCGWT感染的小鼠肺臟內(nèi)產(chǎn)生的結(jié)核結(jié)節(jié)少且不典型，炎性程度低;BCGWT感染的小鼠脾臟內(nèi)的CD4+T 細(xì)胞和CD4+/CD8+及IL12滴度明顯高于BCG△pckA感染的小鼠;BCG△pckA株形成菌落的數(shù)量明顯低于BCGWT株形成菌落的數(shù)量。結(jié)論 pckA基因為結(jié)核桿菌生長所必需，其編碼產(chǎn)物PEPCK能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，可能是一種很好的疫苗候選分子。
　　【關(guān)鍵詞】 結(jié)核桿菌; pckA基因;磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶;免疫保護(hù)

　　The primary research on phosphoenolpyruvate carboxykinase immune effect of mycobacterium tuberculosis

　　BAI Xuelian WANG Zhiqiang DIAO Xinghua et al

　　Department of Parasitology and Biology, Binzhou Medical University, Binzhou 256603

　　【Abstract】 ob[x]jective To research the immune effect of phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) of mycobacterium tuberculosis.Methods Mice were infected with wild type BCG and pckA mutated BCG respectively. The lung histology of infected mice was checked.The number of CD4+ and CD8+ T cells，CD4+/CD8+ were assayed by flow cytometry.Interleukin12 was detected by ELISA. BCG from spleens of two groups of mice was cultured and the number of CFU was taken count.Results Granulomas in pckA mutated BCG (BCG△pckA) infected mice were fewer and more atypical than those in mice infected with wild type (BCGWT). The number of CD4+ T cells and the ratio of CD4+/CD8+ from the BCGWT group were significantly higher than those form BCG△pckA group. The titer of interleukin12 of BCGWT infected mice was higher that that of BCG△pckA group. And the number of BCG CFU from BCGWT group was more than that of BCG△pckA group.Conclusion pckA gene is necessary for the growth of mycobacterium tuberculosis. PEPCK can effectively induce immune responses and can be a good candidate for vaccine.

　　【Key words】 mycobacterium tuberculosis, pckA gene, phosphoenolpyruvate carboxykinase, immune protection

　　結(jié)核病是由結(jié)核桿菌感染所致的慢性傳染病。世界上約有1/3的人感染結(jié)核[1]?，F(xiàn)在使用的預(yù)防結(jié)核的卡介苗，保護(hù)作用從0%～80%不等，很不穩(wěn)定。另外，現(xiàn)在由于藥物的應(yīng)用，多種藥物抗性結(jié)核分枝桿菌已產(chǎn)生。所以尋找既可作為抗結(jié)核的疫苗，又可作為抗結(jié)核藥靶的候選分子是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。基因組分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)核桿菌含有pckA基因，其編碼72 kD的磷酸烯醇型丙酮酸羧基酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)，催化草酰乙酸和磷酸烯醇型丙酮酸之間的可逆性反應(yīng)。PEPCK在結(jié)核致病和誘導(dǎo)機(jī)體免疫中可能起重要作用。本研究用敲除pckA基因的牛結(jié)核菌BCG感染小鼠，觀察引起肺的病理變化和對淋巴細(xì)胞、細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響，并檢測了BCG在體內(nèi)的生長情況;初步研究了結(jié)核桿菌pckA基因編碼的PEPCK對結(jié)核桿菌生長的重要性及其免疫保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究提供了依據(jù)。
　　1 材料與方法
　　1.1 主要試劑及儀器 RPMI 1640培養(yǎng)液購于SCIENCE生物公司，HE和耐酸染劑購于上海市試劑工貿(mào)有限公司。檢測細(xì)胞因子的單抗為美國BD PMG公司產(chǎn)品，堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗大鼠IgG結(jié)合物為美國Sigma公司產(chǎn)品。異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的小鼠IgG2a、藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的IgG2a及兩者的同型對照為美國BD公司產(chǎn)品。FC500型流式細(xì)胞儀購于美國BECKMANCOULTER 公司，旋轉(zhuǎn)薄片切片機(jī)為上海申安醫(yī)藥器械公司產(chǎn)品。
　　1.2 菌株 野生型牛結(jié)核桿菌(BCGWT)及敲除pckA基因的牛結(jié)核桿菌(BCG△pckA)由美國哈佛大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院提供。
　　1.3 實(shí)驗動物 BALB/c小鼠，體質(zhì)量18～22 g,購于山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物中心。
　　1.4 實(shí)驗方法

　　1.4.1 BCGWT和BCG△pckA感染小鼠：選雌性BALB/c小鼠。將BCGWT和BCG△pckA培養(yǎng)至OD600為0.8，用含0.01%吐溫80的PBS洗滌、混勻。將細(xì)菌濃度調(diào)整到1×107個/ml, 每只小鼠尾靜脈注射0.1 ml菌液, 即1×106個細(xì)菌。PBS吐溫80對照組每只小鼠尾靜脈注射 0.1 ml。間隔一定的時間處死小鼠，取脾臟，研成1 mm大小的碎塊，在1 ml PBST中攪碎混勻。用PBS將懸液稀釋，取100 μl鋪板并計算BCG的菌落數(shù)。用于測定T細(xì)胞時，小鼠每2周感染1次，共感染3次。
　　1.4.2 組織學(xué)檢查：取小鼠左側(cè)肺，用10%PBS福爾馬林浸泡24 h。用乙醇逐級脫水，石蠟包埋。用旋轉(zhuǎn)薄片切片機(jī)對包埋塊的三個斷面進(jìn)行切片，厚度為100 μm, 用HE和耐酸染劑進(jìn)行染色，顯微鏡下進(jìn)行觀察。
　　1.4.3 淋巴細(xì)胞的檢測：將第3次感染后14 d的小鼠，無菌取脾，在含有RPMI 1640培養(yǎng)液的平皿中，用針?biāo)ㄆ蕉溯p微擠壓研磨，收集細(xì)胞懸液，然后加紅細(xì)胞裂解液，離心，將沉淀重懸于RPMI 1640培養(yǎng)液中，計數(shù)并將濃度調(diào)致5×106/ml ，用流式細(xì)胞儀(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗室)進(jìn)行測定。
　　1.4.4 細(xì)胞因子的檢測：將以上收集的脾細(xì)胞懸液濃度調(diào)致6.4 ×107/ml 。將該細(xì)胞懸液分別滴入96孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔0.2 ml，培養(yǎng)3 d后，收集上清。取培養(yǎng)液上清包被96孔反應(yīng)板，常規(guī)ELISA法檢測。
　　1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行分析。
　　2 結(jié)果

　　2.1 pckA基因缺失所致的病理變化 病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在BCGWT和BCG△pckA株感染6 h后肺臟沒有明顯的組織學(xué)上的變化。在感染后20 d，肺臟檢查顯示，BCGWT感染的小鼠出現(xiàn)清楚的結(jié)核結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)中含有巨噬細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞、中性白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，有周圍小血管和周圍小淋巴管積聚。而BCG△pckA感染鼠體內(nèi)的結(jié)節(jié)不如野生型BCG感染鼠典型，并且數(shù)量少，炎性程度低(圖1)。
　　2.2 pckA基因?qū)α馨图?xì)胞增殖的影響 用BCG△pckA、BCGWT分別感染小鼠，PBS吐溫80做對照，第三次感染2周后，取小鼠脾臟，用流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞，結(jié)果見表1。表1 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞檢測結(jié)

　　2.3 pckA基因?qū)?xì)胞因子的影響 用BCG△pckA、BCGWT分別感染小鼠，PBS吐溫80做對照，第三次感染2周后，取小鼠脾臟進(jìn)行培養(yǎng)，取培養(yǎng)液上清，用ELISA法檢測細(xì)胞因子IL12，結(jié)果見表2。表2 小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL12細(xì)胞因子檢測結(jié)果注：與對照組比較，* P<0.05

　　2.4 用BCGWT株和 BCG△pckA株感染BALB/c小鼠，取脾臟進(jìn)行結(jié)核桿菌的培養(yǎng)，結(jié)果顯示，由第14天開始，BCG△pckA株形成菌落的數(shù)量明顯低于BCG野生型株形成菌落的數(shù)量(P<0.01，表3)。
　　表3 每毫升脾細(xì)胞懸液培養(yǎng)菌落數(shù)對數(shù)結(jié)果(x±s)組別4 d10 d20 d35 d56 dBCGWT4.9±0.215.3±0.194.7±0.254.8±0.174.6±0.15BCG△pckA4.7±0.155.1±0.164.4±0.224.2±0.234.2±0.25

　　3 討論

　　結(jié)核是由結(jié)核桿菌引起的對人類健康威脅很大的一種慢性疾病。由于以往所用的卡介苗對人類的保護(hù)作用很不穩(wěn)定，所以現(xiàn)在人們需要尋找新的更好的抗結(jié)核疫苗或藥物的靶點(diǎn)。本研究用BCGWT感染的小鼠肺臟內(nèi)產(chǎn)生明顯的結(jié)核結(jié)節(jié)，而用BCG△pckA感染的小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的結(jié)節(jié)不典型且數(shù)量少，炎性程度低。結(jié)核結(jié)節(jié)是結(jié)核桿菌感染的主要特征性免疫病理變化，是機(jī)體產(chǎn)生有效保護(hù)性免疫反應(yīng)的表現(xiàn)。結(jié)核結(jié)節(jié)的結(jié)構(gòu)內(nèi)層為被包裹的結(jié)核菌，再外層為中性粒細(xì)胞、類上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，外層為纖維母細(xì)胞形成的纖維層。結(jié)核結(jié)節(jié)的形成把結(jié)核菌包裹起來，對于防止其擴(kuò)散起到很重要的作用。由此可知，pckA基因編碼的PEPCK能夠有效的刺激機(jī)體產(chǎn)生結(jié)核結(jié)節(jié)，對機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用。
　　結(jié)核桿菌寄生在巨噬細(xì)胞內(nèi)，是引起機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)的主要病原體。本實(shí)驗中用BCGWT感染后，小鼠CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+均明顯的高于用BCG△pckA感染的小鼠，即pckA基因產(chǎn)物能夠刺激CD4+T細(xì)胞增多、活化。CD4+T細(xì)胞是介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的主要細(xì)胞，也被認(rèn)為是抗結(jié)核感染的主要細(xì)胞[2，3]，尤其是Th1細(xì)胞在抗結(jié)核的免疫反應(yīng)中起到很重要的作用。有人檢測發(fā)現(xiàn)結(jié)核感染時CD4+T細(xì)胞向肺部聚集[4，5]。 CD4+T細(xì)胞的增多表明細(xì)胞免疫的增強(qiáng),對結(jié)核桿菌的殺傷作用增強(qiáng)。本研究中用BCGWT感染的小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的IL12明顯高于BCG△pckA組。IL12在抗結(jié)核的免疫反應(yīng)中起到很重要的作用，IL12能夠誘導(dǎo)IFNγ的產(chǎn)生，抑制IL4的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)1型細(xì)胞因子和2型細(xì)胞因子之間的平衡，這對于幼稚性T細(xì)胞向Th1分化是十分重要的[6]。IL12也是NK細(xì)胞和T細(xì)胞的激活劑，尤其對NK細(xì)胞激活作用顯著。乳鐵蛋白能夠通過提高IL12/ IL10的比率增加IL12的產(chǎn)生[7]。Feng等[8]研究發(fā)現(xiàn)IL12 p40缺陷的小鼠在開始時表現(xiàn)出抑制結(jié)核菌的生長，延長生存天數(shù)，但后不可避免的感染上結(jié)核，這表明IL12的產(chǎn)生對于維持肺內(nèi)Th1細(xì)胞的數(shù)量是必需的，阻斷IL12的產(chǎn)生會造成疾病復(fù)發(fā)。人類如果IL12基因缺陷也表現(xiàn)出對散在BCG的易感性[9]。本研究還取分別用BCGWT和 BCG△pckA感染的小鼠脾臟進(jìn)行結(jié)核桿菌的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)由第14天開始，BCG△pckA株形成菌落的數(shù)量明顯低于BCG野生型株形成菌落的數(shù)量，這與機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的時間相符，表明PEPCK可保護(hù)細(xì)菌免受宿主的殺傷。
　　綜上所述，pckA基因是結(jié)核桿菌的重要基因，為結(jié)核桿菌生長所必需， 其產(chǎn)物即磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶(PEPCK)能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性細(xì)胞因子，活化CD4+T細(xì)胞，從而有效的誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答。可見PEPCK是一種很好的疫苗或者抗結(jié)核藥靶候選分子。
　　【參考文獻(xiàn)】
　　[1] Dye C, Scheele S, Dolin P,et al.Consensus statement. Global burden of tuberculosis: estimated incidence, prevalence, and mortality by country. WHO Global Surveillance and Monitoring Project[J]. JAMA，1999, 282:677686.

　　[2] Mustafa AS, Kvalheim G, Degre M,et al.Mycobacterium bovine BCGinduced human Tcell clones from BCGvaccinated healthy subjects: antigen specificity and lymphokine production[J].Infect Immun, 1986, 53(3): 491497.

　　[3] Hernandez HJ, Y Wang, N Tzellas,et al.ex[x]pression of class II, but not class I, major histocompatibility complex molecules is required for granuloma formation in infection with Schistosoma mansoni[J].Eur　J Immunol, 1997, 27(5): 11701176.

　　[4] Lyadova IV, Eruslanov EB, Khaidukov SV,et al.Comparative analysis of T lymphocytes recovered from the lungs of mice genetically susceptible, resistant, and hyperresistant to Mycobacterium tuberculosistriggered disease[J].J Immunol, 2000, 165(10): 59215931.

　　[5] JunqueiraKipnis AP, Turner J, GonzalezJuarrero M,et al. Stable Tcell population expressing an effector cell surface phenotype in the lungs of mice chronically infected with Mycobacterium tuberculosis[J].Infect Immun, 2004, 72(1): 570575.

　　[6] Chen J, Dong D, Yang Y. The effect of interleukin12 on the production of Th1(1) and Th(2) cytokines by peripheral blood mononuclear cells from patients with tuberculosis[J].Zhonghua Jie He Hu Xi Za Zhi, 2002, 25(5): 292295.

　　[7] Hwang SA, Kruzel ML, Actor JK. Lactoferrin augements BCG vaccine efficacy to generate T helper response and subsequent protection against challenge with vivulent mycobacterium tuberculosis[J]. Int Immunopharmacol, 2005, 5(3): 591599.

　　[8] Feng CG, Jankovic D, Kullberg M.Maintenance of Pulmonary Th1 Effector Function in Chronic Tuberculosis Requires Persistent IL12 Production[J].J Immunol，2005, 174(7): 41854192..

　　[9] Ottenhof TH, Kumararatne D, Casanova JL. Novel human immunodeficiencies reveal the essential role of type1 cytokines in immunity to intracellular bacteria[J].Immunol Today，1998, 19:491494.