增殖1阻斷基因在肝癌組織中上調(diào)并促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移

　　肝細(xì)胞肝癌是惡性程度高的腫瘤之一,目前肝癌形成和發(fā)展的分子機(jī)制仍不甚明了,研究結(jié)果顯示其與眾多基因的異常表達(dá)有關(guān).一些基因在組織的惡性轉(zhuǎn)變、腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用,增殖1阻斷(BOP1)基因是新近發(fā)現(xiàn)的定位于染色體8q24上的腫瘤相關(guān)基因,研究結(jié)果顯示此段的區(qū)域染色體擴(kuò)增在人類多種腫瘤發(fā)生中很常見乞2l.有報道稱BOPl參與結(jié)直腸癌的發(fā)生,其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的臨床病理特征有密切關(guān)系.目前BOP1基因在不同腫瘤中的研究較少,在多種腫瘤中的表達(dá)報道目前尚少.
　　有關(guān)文獻(xiàn)稱BOP1基因可促進(jìn)上皮向間質(zhì)的轉(zhuǎn)變(EMT),進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、推測BOPl的表達(dá)可能會與肝癌的發(fā)生有關(guān).本研究旨在觀察BOPl基因在肝癌組織中的表達(dá)及對肝癌細(xì)胞功能的影響.
　　材料和方法 　　
　　1一般資料:實(shí)驗標(biāo)本取自上海市人民醫(yī)院診治的45例男性肝癌患者,并取相應(yīng)的距離腫瘤組織>5cm的正常肝臟組織做為對照.樣本組織全部獲得病理學(xué)診斷:肝細(xì)胞肝癌.mRNA提取試劑盒(Qiagen公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)試劑盒(Fermentas公司),肝癌HepG2細(xì)胞株購自中國科學(xué)院土二海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心.PEGFP-N1-BOP1重組載體由上海銳賽生物技術(shù)有限公司構(gòu)建Lipofectamine2000,Trizol試劑(美國Invitrogen公司),胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibc.公司),蛋白提取濃度測定試劑盒(碧云天公司),鼠抗人綠色熒光蛋白(GFP)單抗、鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單抗(美國SantaCruz公司),細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)試劑盒(日本同仁公司),FQ-PCR儀器購自德國Eppendorf公司.
　　2.mRNA的提取和cDNA合成:mRNA的提取按照AllprepDNA/RNAMiniHandbook進(jìn)行操作,用ThermoScientificNanoDrop2000/20000分光光度計檢測提取的mRNA濃度,并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA質(zhì)量.逆轉(zhuǎn)錄采用Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,反應(yīng)體系為20閃:mRNA3Ng(根據(jù)mRNA濃度取相應(yīng)體積),隨機(jī)引物1閃,緩沖液4閃,Rnase抑制劑1閃,10mmol/LdNTPMix2閃,逆轉(zhuǎn)錄酶1閃,無核酸酶水補(bǔ)足20p,1.反應(yīng)條件為:250C5min,420C60min,70℃5min.
　　3.FQ-PCR過程:依據(jù)SYBRGreenqPCRMasterMix進(jìn)行.為校準(zhǔn)每微升體積cDNA含量的不同,選用18S作為內(nèi)參,引物見表1,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10min,然后95℃變性10s,60℃退火20s,720C延伸1min,共42個循環(huán),再進(jìn)人融解程序:95℃5s,55℃5s,95℃5、.用2一,計算結(jié)果.
　　4.BOPl基因pEGFP-NI表達(dá)載體的構(gòu)建:針對BOPl基因CDS區(qū)設(shè)計并合成PCR引物(表1),在目的基因的5’端添加XhoI酶切位點(diǎn),3’端添加EcoRI酶切位點(diǎn).以購買的基因為模板,PCR擴(kuò)增BOPl基因序列,PCR體系50閃,反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性3min,然后940C變性30s,56℃退火30s,68℃延伸140s,共35個循環(huán),再68℃充分延伸10min.分離回收目的片段,將目的基因片段與pEGFP-N1連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DHS.篩選PCR和酶切鑒定均呈陽性的克隆測序驗證.PFGFP-N1-BOPI質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖見圖1.
　　5.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:HepG2置于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中,在37℃,5%COz、飽和濕度條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng),細(xì)胞生長至90%融合時消化傳代.轉(zhuǎn)染時取對數(shù)生長期的細(xì)胞約1x105個孔接種于12孔板,加人適量RP'VTI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,使細(xì)胞生長穩(wěn)定并達(dá)到50%一60%的貼壁融合)按Lipofectarmine2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染分實(shí)驗組(轉(zhuǎn)染目的基因BOPl的質(zhì)粒pEGFP-Nl-BOPl)、對照組(轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒,pEG-FP-NC)、親本細(xì)胞組(未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞),于轉(zhuǎn)染6h后更換培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱中孵育48,72h后收集細(xì)胞二倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率.
　　6.BOP1基因在HepG2細(xì)胞中的表達(dá):收集各組HepG2細(xì)胞,按Trizol和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書分別提取細(xì)胞總RNA和逆轉(zhuǎn)錄為cDNA.采用SybrGreenFQ-PCR檢測細(xì)胞中BOPlmRNA的表達(dá),選用18S作為內(nèi)參,引物見表1,用公式2-o}}}計算表達(dá)差異.采用Westernblot檢測各組細(xì)胞中BOP1蛋自的表達(dá).
　　按照說明書提取細(xì)胞總蛋白并測定濃度,聚丙烯凝膠分離,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉,依次用鼠抗人GFP單克隆抗體(1:1000稀釋)、鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1:5000稀釋)的一抗孵育和羊抗鼠辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1:5000稀釋)孵育,化學(xué)發(fā)光法顯影檢測.
　　7.細(xì)胞增殖實(shí)驗:將處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞約3x103個/孔接種于無菌96孔板(100p,1/孔),24h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染,同樣分為實(shí)驗組、對照組、親本細(xì)胞組,每組設(shè)3個平行孔.在轉(zhuǎn)染后的1一5d,每孔加人10瀏的CCK-8液,37℃5%C0,培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h,用酶標(biāo)儀測定450nm的吸光度(A)值.
　　8.細(xì)胞遷移實(shí)驗:將HepG2細(xì)胞按6/10a個細(xì)胞/孔密度接種于6孔板,培養(yǎng)24h至細(xì)胞融合達(dá)50%左右,轉(zhuǎn)染及分組同細(xì)胞增殖實(shí)驗.待細(xì)胞長至70%一80%融合時,用1000閃無菌移液器槍頭沿培養(yǎng)板底部劃1條直線,寬約8mm,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗,洗去被劃下的細(xì)胞.在倒置顯微鏡下觀察劃痕后12,24,36,48,60,72h細(xì)胞的遷移,并測量細(xì)胞向中線移動的距離.
　　9.統(tǒng)計學(xué)方法:應(yīng)用S1'SS16.0統(tǒng)計軟件分析,計量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間差異比較采用配對t檢驗和方差分析.
　　結(jié)果
　　1.FQ-PCR結(jié)果:BOP1mR1VA在45例肝癌及其相應(yīng)正常組織中,有39例在腫瘤組織中(86.7%o)表達(dá)上調(diào),而僅有2例(4.4%)表達(dá)降低,4例(8.9%)在正常組織和腫瘤組織中表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.O5).BOPlmRNA在腫瘤組織表達(dá)水平為巧.16士1.86,正常組織為17.48士2.68,肝癌組織表達(dá)量明顯高于正常組織(P<0.01,圖2).
　　2.轉(zhuǎn)染效率的倒置熒光顯微鏡下觀察:pFGFP-NC,pEGFP-1V1-BOPl分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞48h,72h后,倒置熒光顯微鏡下可見各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中呈現(xiàn)綠色熒光,72h熒光強(qiáng),轉(zhuǎn)染效率約為50%,親本細(xì)胞組未見綠色熒光.
　　3.BOPl在HepG2細(xì)胞中的過表達(dá):轉(zhuǎn)染72h后,FQ-PCR結(jié)果顯示,親本細(xì)胞組和對照組BOP1mRNA相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而實(shí)驗組表達(dá)量顯著上調(diào)(>80倍).Westernblot法結(jié)果顯示,親本細(xì)胞組未出現(xiàn)目的蛋白條帶,轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的對照組僅出現(xiàn)GFP蛋白條帶(相對分子質(zhì)量為26x103),而實(shí)驗組出現(xiàn)GFP和BOP1的融合條帶(相對分子質(zhì)量為犯x103).以上結(jié)果表明基因轉(zhuǎn)染成功,見圖3.
　　

　　4.細(xì)胞增殖實(shí)驗結(jié)果:親本細(xì)胞組(HepG2)、對照組(HepG2-N};)和實(shí)驗組(HepG2-BOP1)在轉(zhuǎn)染后的1一Sd經(jīng)CCK-8檢測結(jié)果顯示親本細(xì)胞組和對照組細(xì)胞的A值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而實(shí)驗組細(xì)胞的A值顯著升高,過表達(dá)BOPl能明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖(P<0.05,圖4).
　　5.細(xì)胞遷移實(shí)驗結(jié)果:轉(zhuǎn)染后每12h連續(xù)觀察測量,結(jié)果顯示實(shí)驗組向劃痕部位遷移的速度明顯加快,72h時親本細(xì)胞組和對照組劃痕仍有縫隙,而實(shí)驗組完全愈合,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,圖5).
　　討論
　　BoPi基因是一個}VD40蛋自,發(fā)現(xiàn)是與小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的成長有關(guān)一s}.早期在小鼠成纖維細(xì)胞的研究結(jié)果顯示BOPl參與核糖體RNA的生成,與其完整性有關(guān)然而,近來的研究著重于BOP1在核糖體外的功能.研究結(jié)果顯示,在酵母中BOPl通過在有絲分裂中期向后期的過渡中精確染色體的分離,在維持基因組的完整性中發(fā)揮重要作用〔}J.在染色體中,BOPI和Peseadillo(Pesl)形成一種穩(wěn)定的復(fù)合體,據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)稱,失去Pesl-BOPl復(fù)合體的完整性可以導(dǎo)致前rRNA的成熟缺陷和TP53依賴的細(xì)胞周期停滯〔7〕,這和腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系.在結(jié)直腸癌,BOP1的過表達(dá)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生,在染色體的不穩(wěn)定和組織的惡性轉(zhuǎn)變中起重要作用s}
　　目前研究BOPl與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系國內(nèi)尚無報道.在前期實(shí)驗中,我們選取45例肝癌患者的腫瘤組織和相應(yīng)正常組織,通過FQ-PCR檢測BOPlmRNA的表達(dá),發(fā)現(xiàn)BOPl基因在腫瘤組織的表達(dá)顯著高于相應(yīng)正常組織,這種差異表達(dá)促使我們思考BOPl的高表達(dá)在肝癌發(fā)生、發(fā)展中可能的作用.目前,基因克隆、基因轉(zhuǎn)染已成為明確基因功能的主要手段{yJ,為進(jìn)一步深人研究,我們采取克隆構(gòu)建BOP1真核過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株的方法觀察BOP1基因過表達(dá)對細(xì)胞功能的影響.
　　增殖和運(yùn)動特性的差異是腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞顯著的一面,因此本實(shí)驗中我們主要檢測BOP1過表達(dá)在這兩方面的作用.考慮到肝癌HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率比較高,屬于低侵襲性低轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞株,這樣有利于運(yùn)動遷移實(shí)驗的結(jié)果較為明顯一些,故選擇肝癌HepG2細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗通過FQ-PCR,Westernblot方法驗證轉(zhuǎn)染成功,可見過表達(dá)BOP1基因可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖,實(shí)驗組細(xì)胞的A值顯著高于對照組,說明實(shí)驗組細(xì)胞的增殖速度要明顯快于對照組.在劃痕遷移實(shí)驗中,通過轉(zhuǎn)染后每隔12h連續(xù)3d觀察細(xì)胞向中線的遷移,我們觀察到實(shí)驗組劃痕的愈合速度明顯快于對照組,說明過表達(dá)BOPl可以明顯提高HepG2細(xì)胞的運(yùn)動能力.
　　本研究結(jié)果表明,BOPl基因在肝癌組織中表達(dá)上調(diào),并且可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力,因此BOPl基因促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展,但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究.
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