白蛋白對近端腎小管上皮細胞增殖與凋亡的影響

【摘要】  【目的】 探討白蛋白對近端腎小管上皮細胞（PTCs）增殖與凋亡的影響?！痉椒ā?用不同劑量（0.1，0.5，1，5，10，30 mg/mL）去脂牛血清白蛋白(dBSA)超載體外培養(yǎng)的NRK52E，dBSA 0 mg/mL作為對照。細胞增殖活性用MTS比色法檢測和顯微鏡觀察。細胞凋亡檢測：熒光染料DAPI染核，DNA梯帶實驗，原位末端標記（TUNEL）實驗和苔盼藍染色計數。【結果】 高劑量dBSA超載未完全融合NRK52E細胞144 h后細胞變得更密集。MTS比色結果發(fā)現，高劑量dBSA（5、10、30 mg/mL）超載可明顯誘導NRK52E細胞增殖，增殖活性分別為（0.700 ± 0.045）A、（1.021 ± 0.029） A和（1.273 ± 0.173） A，較對照細胞（0.441 ± 0.020） A顯著升高，P均 < 0.05。高劑量dBSA超載的NRK52E細胞，有較多出現核碎裂和核固縮，有較強DNA梯帶和原位末端標記信號。苔盼藍染色計數發(fā)現，高劑量dBSA（5、10、30 mg/mL）超載NRK52E細胞72 h的死亡細胞數[（680 000 ± 28 618）/mL， （970 000 ± 52 915）/mL和（1 132 500 ± 88 954）/mL較對照的死亡細胞數［（312 500 ± 28 395）/mL]顯著升高， P均 < 0.05；而且死亡細胞數呈劑量依賴性。【結論】白蛋白超載NRK52E細胞既可誘導細胞增殖，又可誘導細胞凋亡。

【關鍵詞】  白蛋白; 腎小管上皮細胞; 細胞增殖; 細胞凋亡

    Effects of Albumin on Proliferation and Apoptosis in Proximal Renal Tubular Cells

    SUN Liang-zhong, YUE Zhi-hui, CHEN Shu-mei

    ( Department of Pediatrics，The First Affiliated Hospital, SUN Yat-Sen University, Guangzhou, 510080, P.R. China )

    Abstract: 【ob[x]jective】 To study the effects of albumin overload on proliferation and apoptosis in proximal tubular epithelial cells (PTCs). 【Methods】 Different concentration of delipidated bovine serum albumin (dBSA) ranged from 0.1-30 mg/mL were added to NRK52E cells cultured in vitro; dBSA 0 mg/mL as control. Cell proliferation was observed under microscope and measured by One Solution Cell Proliferation Assay Kit (MTS assay). Apoptosis were detected by following methods: DNA laddering assay, In situ terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL assay), nuclei changes were observed under immunofluorecent microscope after stained with DAPI (4′,6-diamidino -2-phenylindole) and total death cells were counted with trypan blue staining under light microscope. 【Results】Under light microscope, sub-confluent NRK52E cells became more confluent after dBSA overload 144 h. MTS assay revealed that higher dosages of dBSA (5, 10, and 30 mg/mL) overload induced significant proliferation (0.700 ± 0.045A, 1.021 ± 0.029 A, and 1.273 ± 0.173 A, respectively) 48 hours later in NRK52E, and were higher than that of control cells (0.441 ± 0.020 A), P< 0.05. In higher dosages of dBSA (5, 10, and 30 mg/mL) overload NRK52E cells, there were more condensed or broken nuclei, stronger DNA ladders and more positive signals in TUNEL assay than those in lower dosages of dBSA overload or control NRK52E cells. Trypan blue staining revealed that death cells in higher dosages of dBSA (5, 10, and 30 mg/mL) overload NRK52E (680 000 ± 28 618/mL, 970 000 ± 52 915/mL, and 1 132 500 ± 88 954/mL, respectively) were higher than that of control cells (312 500 ± 28 395/mL), P< 0.05; And death cells increased in a dose-dependent manner after dBSA overload. 【Conclusion】 Albumin overload could induce proliferation and apoptosis in PTCs.

    Key words: albumin; proximal tubular epithelial cells; proliferation; apoptosis

    [J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28（６）:649-653]

    蛋白尿作為眾多腎小球疾病的共同特點，不僅提示腎小球的損害程度，而且可能導致腎小管間質損害，促進疾病的進展[1, 2]。但是蛋白尿引起腎小管間質損害的機理仍未完全明了，目前也缺乏有效的預防和治療措施[3]。白蛋白是蛋白尿的主要成分[4]。早期研究發(fā)現，白蛋白超載近端腎小管上皮細胞（proximal tubular epithelial cells, PTCs），即在培養(yǎng)液加入大劑量白蛋白，可誘導PTCs增殖，但另有研究發(fā)現，大劑量白蛋白超載可誘導近端及遠端腎小管上皮細胞凋亡[5, 6]。我們前期研究發(fā)現，在大鼠阿霉素腎病模型中，大量蛋白尿持續(xù)一段時間（20周）后有大量腎小管上皮細胞發(fā)生凋亡[7-9]。過度的細胞增殖或細胞凋亡都是病理狀態(tài)下的表現，都可能促進疾病進展[9,10]。白蛋白超載PTCs后是誘導細胞增殖還是凋亡，目前尚沒有一致意見[11]。本研究擬觀察白蛋白超載PTCs對細胞增殖和凋亡兩方面的影響，以進一步探討白蛋白對PTCs的損害機制。

    1   材料和方法

    1.1   細胞培養(yǎng)

    正常大鼠近端腎小管上皮細胞株（Normal rat kidney cell line 52E, NRK52E）細胞接種在6孔培養(yǎng)板或每孔含有4片小圓蓋玻片的6孔培養(yǎng)板上。細胞培養(yǎng)至70％融合（未完全融合）或100％融合（完全融合）后，用無血清DMEM洗2次，去血清培養(yǎng)24 h。然后分別給予不同劑量的去脂牛血清白蛋白(delipidated bovine serum albumin, dBSA)，劑量范圍：0.1~30 mg/mL, dBSA 0 mg/mL作為對照。實驗觀察48 h和72 h。dBSA超載后在顯微鏡下觀察細胞生長情況，部分實驗觀察至dBSA超載后144 h。

    1.2   細胞增殖活性的檢測

    細胞增殖活性檢測用Promega公司 CellTiter 96?誖 AQueous 細胞增殖一步法檢測試劑盒，即四甲基偶氮唑鹽［3- (4, 5- dimethylthiazol -2- yl) -5- (3- carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium，inner salt; MTS］改良比色法檢測。按說明書方法進行。為了消除死亡細胞對結果的影響，取630 nm 濾光片測得的結果為實際值。所有實驗組和對照組均重復3次。

    1.3   細胞凋亡的檢測

    1.3.1   細胞核形的觀察   dBSA超載至72 h后，用PBS洗滌3遍培養(yǎng)在蓋玻片上的NRK52E細胞。加入-20 ℃固定液（甲醛：丙酮，7 ∶ 3混合）固定10 min。用抗大鼠E-鈣粘蛋白抗體（BD Biosciences）的免疫熒光實驗顯示細胞膜的情況，滴加含5 μg/mL （4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI，Vector Laboratories)的封片膠至細胞面染核后，封片。熒光顯微鏡觀察細胞核形變化，照相。

    1.3.2  DNA梯帶試驗   用Calbiochem 公司的Suicide-TrackTM DNA 梯帶分離試劑盒。按說明書方法進行。

    1.3.3   原位末端缺口標記細胞凋亡檢測法   （ In situ terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL法） 用Roche熒光標記原位細胞死亡檢測試劑盒。按說明書方法進行。

    1.3.4   苔盼藍染色計數死亡細胞   不同劑量dBSA，0，0.1，0.5，1，5，10，30 mg/mL，超載NRK52E細胞72 h后，收集懸浮細胞和胰酶消化的細胞。離心沉淀后，用生理鹽水重懸細胞，取等量細胞懸液與苔盼藍（Sigma）混合，調整每大方格細胞數為20-50格，5 min后在顯微鏡下計數，著色的細胞為死亡細胞；實驗重復3次。

    1.4   統(tǒng)計分析

    所有數據用均數 ± 標準差表示。數據分析用Kruskal-Wallis方法。所有檢驗用SPSS 11.5處理. P < 0.05視為差異有顯著性。

    2   結   果

    2.1   dBSA超載NRK52E細胞誘導細胞增殖

    MTS比色結果顯示高劑量dBSA（5、10、30 mg/mL）超載NRK52E細胞的增殖活性較對照細胞明顯升高，差異有顯著性，P均 < 0.05；低劑量dBSA（0.1、0.5、1.0 mg/mL）超載NRK52E細胞的增殖活性較對照細胞也有升高，但差異無顯著性，P均 > 0.05（圖1，表1）。顯微鏡下觀察細胞生長至dBSA超載后144 h發(fā)現，高劑量dBSA（5、10、30 mg/mL）超載的未完全融合（70％融合度）NRK52E細胞變得更密集（圖2）。

    2.2   dBSA超載NRK52E細胞誘導細胞凋亡

    2.2.1   顯微鏡下細胞核形變化  dBSA超載NRK52E細胞72 h后有部分細胞懸浮在培養(yǎng)液中，在高劑量dBSA（5，10，30 mg/mL）超載的NRK52E更為明顯。熒光顯微鏡下觀察用DAPI染核的培養(yǎng)在蓋玻片上的細胞發(fā)現，高劑量dBSA（5，10，30 mg/mL）超載的NRK52E細胞，有較多細胞核出現核碎裂和核固縮（圖3），部分細胞與鄰近的細胞分離。低劑量和對照組的細胞偶見核碎裂和核固縮，無明顯細胞分離現象。

    2.2.2   DNA梯帶實驗結果   高劑量dBSA（5，10，30 mg/mL）超載的NRK52E細胞有較強DNA梯帶，低劑量dBSA（0.5，1.0 mg/mL）超載的和對照NRK52E細胞則只有較弱DNA梯帶，正常培養(yǎng)（用含5％FCS的DMEM培養(yǎng)）的NRK52E細胞，沒有明顯DNA梯帶（圖4）。

    2.2.3   TUNEL實驗   對培養(yǎng)在蓋玻片上的NRK52E細胞進行熒光標記TUNEL實驗。結果也發(fā)現，高劑量dBSA（5，10，30 mg/mL）超載NRK52E細胞有較多的陽性信號。低劑量dBSA（0.5，1.0 mg/mL）超載的和對照NRK52E細胞陽性信號較少（圖5）。

    2.2.4   苔盼藍染色計數結果   高劑量dBSA超載（5，10，30 mg/mL）超載NRK52E細胞72 h的死亡細胞數較對照和低劑量dBSA（0.1，0.5，1.0 mg/mL）超載NRK52E細胞的死亡細胞數明顯增加，差異有顯著性，P均 < 0.05（表2）；而且死亡細胞數的增加與dBSA超載呈劑量依賴性（圖6）。

    3   討   論

    細胞增殖和凋亡是細胞生長過程的兩種生物學現象，存在于組織器官的新陳代謝過程中，適當的細胞增殖和凋亡是維持組織器官正常結構和功能所必須的。但是過度的細胞增殖或凋亡則可造成組織器官結構和功能的喪失，是病理狀態(tài)下表現。白蛋白超載是眾多伴有大量蛋白尿的腎臟疾病所存在的一種狀態(tài)。本研究發(fā)現，白蛋白超載PTCs對細胞增殖和凋亡均有激活作用。這可能是蛋白尿造成腎小管間質損害的重要方面。

    細胞增殖和凋亡是兩種對立的生物學過程。在病理因素作用下，細胞繼續(xù)生存或死亡是細胞面臨的兩種對立的生物學選擇。對于一個細胞來講，只能選擇其一；生存的細胞可能發(fā)生增殖或轉型，死亡的細胞可能發(fā)生凋亡或壞死。對于一組細胞來講，終做出哪一個選擇，除了受病理損傷因素性質和強弱的影響外，還與細胞本身的狀態(tài)、鄰近細胞的調節(jié)信號和周圍環(huán)境等因素有關[10]。因此，在同一作用因素下，有的細胞可能發(fā)生增殖，有的則可能發(fā)生凋亡甚至壞死。本研究發(fā)現，在白蛋白超載情況下，PTCs既有發(fā)生增殖，又有發(fā)生凋亡，并不是矛盾的結果。這除了說明白蛋白超載對PTCs有損傷作用外，還提示白蛋白超載對PTCs的損傷機制是復雜的。

    白蛋白引起PTCs增殖和凋亡的機理仍有待進一步明確。早期研究發(fā)現，白蛋白超載可激活磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinositide 3-Kinase, PI3K），誘導PTCs增殖[5]。另有研究發(fā)現，較大劑量的白蛋白（大于5 mg/mL）超載可誘導fas抗原表達，通過激活fas-FADD-capspase-8信號通路引起PTCs凋亡[6]。在白蛋白超載的小鼠模型，有研究發(fā)現促進細胞凋亡的神經膠質成熟因子-?茁（glia maturation factor-?茁, GMF-?茁）在PTCs表達增加，PTCs的抗氧化酶活性降低。說明在白蛋白超載的情況下，PTCs易于發(fā)生凋亡[12]。

    近年來有觀點認為，白蛋白引起PTCs增殖和凋亡可能與H2O2的產生有關[13]。白蛋白超載PTCs可激活蛋白激酶-C（protein kinase C，PKC），后者激活NADPH氧化酶，產生超氧陰離子和H2O2[11]。在腫瘤細胞，有研究發(fā)現H2O2可激活凋亡信號調節(jié)激酶－1（apoptosis signal-regulating kinase 1, ASK1），激活的ASK1可促進P38和JNK（junctional adhesion molecules, JNK）的磷酸化，進而激活caspases，誘導細胞凋亡。而H2O2同時又可激活PI3K和Akt /PKB（protein kinase B），抑制ASK1活性。目前認為，白蛋白超載PTCs時，上述兩條信號途徑均被H2O2激活。上述信號網絡終導致細胞凋亡或增殖取決于H2O2所產生氧化作用的強度。但這一觀點尚未完全在白蛋白超載PTCs上證實[11]。

    總之，本研究表明，白蛋白超載對PTCs有損傷作用，既可誘導PTCs增殖，又可誘導PTCs凋亡。

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作者：孫良忠， 岳智慧， 陳述枚

作者單位：（ 中山大學附屬醫(yī)院兒科， 廣東 廣州 510080 ）