囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子表達(dá)率與人精子受精能力的關(guān)系

作者：李楚艷1,2,李坤2,陳璋輝2,于建民2　　作者單位：1. 溫州醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)院，浙江 溫州 325035;2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生殖醫(yī)學(xué)研究中心 生殖生理研究室，浙江 杭州

　　【摘要】目的：研究人精子囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conduc-tance regulator，CFTR)表達(dá)率與精子受精能力間的關(guān)系。方法：運(yùn)用間接免疫熒光法及蛋白印跡分析法研究CFTR在人精子上的表達(dá)及其在不同類型(生育組、不明原因性不育組及不育組)精子上的表達(dá)率情況。結(jié)果：通過間接免疫熒光法發(fā)現(xiàn)CFTR表達(dá)在人精子赤道板上，蛋白印跡分析進(jìn)一步證實(shí)人精子中存在CFTR，分子量為170 kD;采用間接免疫熒光技術(shù)，CFTR在生育組、不明原因性不育組及不育組(包括畸形精子癥、弱精癥、少精癥)上的表達(dá)率有顯著差異：CFTR在生育組精子上的表達(dá)率(88.13%±3.79%)遠(yuǎn)高于不明原因性不育組(52.93%±15.36%)及不育組(35.89%±20.41%)(P?<0.01)。結(jié)論：CFTR表達(dá)率下降與人精子受精能力降低有關(guān)。

　　【關(guān)鍵詞】 囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子;表達(dá)率;人精子;受精能力

　　Abstract: ob[x]jective: To investigate the correlation between percentage of human sperm expressing CFTR and sperm fertilizing capacity. Methods: The ex[x]pression of CFTR on spermatozoa was conducted by indirect immunofluorescence staining and Western Blot Analysis. And the percentage of spermatozoa expressing CFTR from fertile， unexplained infertile and infertile men?(mainly teratospermic， asthenospermic and oligospermic)?was examined with indirect immunofluorescence staining. Results:CFTR protein was localized to the equatorial segment of sperm head and molecular weight was approximately 170 kD. And the percentage of spermatozoa expressing CFTR in fertile men was signifi-cantly different from that in the unexplained infertile men and infertile men categories，the fertile men spermatozoa greatly higher?(88.13%±3.79%)than that the unexplained infertile men (52.93%±15.36%) and infertile men (35.89%±20.41%) (P?<0.01). Conclusion: The defective ex[x]pression percentage of CFTR in human sperm is related to a reduction of sperm fertilizing capacity.

　　Key words: CFTR;ex[x]pression percentage;human sperm;sperm fertilizing capacity

　　囊性纖維化病(cystic fibrosis，CF)是由囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conduc-tance regulator，CFTR)基因突變引起的一種遺傳性疾病，其臨床表現(xiàn)是進(jìn)行性肺衰竭、胰腺功能不全及兩性不育等。將近97%男性CF患者因?yàn)橄忍煨噪p側(cè)輸精管缺失(CBAVD)[1-2]、先天性單側(cè)輸精管缺失(CUAVD)[3]及楊氏綜合征(Young’s syndrome)[4]而致不育。Van der Ven等[5]報(bào)道17.5%男性不育是因?yàn)榫淤|(zhì)量下降，14.3%少精癥患者至少有一個CFTR基因突變，這些結(jié)果指出CFTR除了對附睪腺及輸精管發(fā)生有重要作用以外，也可能參與精子的發(fā)生和成熟。我們以前的研究表明CFTR表達(dá)在精子赤道板上，且與小鼠精子生殖能力相關(guān)[6]，那么成熟人精子上CFTR表達(dá)率是否與精子生殖能力有關(guān)?CFTR在精子上的表達(dá)率是否能作為評價(jià)精子受精能力的指標(biāo)?為此我們進(jìn)行了深入研究。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 主要試劑：CFTR抗體是從Abcam公司(英國)購買的鼠源性單克隆抗體(CF3 Ab2784)，保存在-20 ℃以備用。兔免疫前IgG購于R&D Systems Inc(美國);鼠源β-actin抗體為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。辣根過氧化酶交聯(lián)的羊抗鼠IgG以及Alexa fluor 488交聯(lián)的羊抗鼠IgG均購自Molecular Probes公司(美國)。Hochest 33258 購于Sigma 公司(美國)。封閉用的羊血清由北京成文免疫研究室提供，硝酸纖維素膜購自Bio-Rad公司(美國)，X-膠片為日本富士株式會社產(chǎn)品。研究用的100 mL PBS工作液包含有0.818 g NaCl，0.02 g KCl，0.027 g KH2PO4，0.287 g Na2HPO4·12H2O。

　　1.1.2 精液標(biāo)本：根據(jù)WHO規(guī)定，本研究中正常精液參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：密度≥20×106/mL;活力(a+b)%≥50%;正常形態(tài)%≥15%。生育男性(年齡在27～39歲之間)是指其配偶在1年內(nèi)已自然受孕且精液常規(guī)分析參數(shù)在正常范圍之內(nèi)的男性;不明原因性不育男性(年齡在23～41歲之間)是指其配偶在沒有采取任何避孕措施情況下1～2年內(nèi)沒有自然受孕的患者，但其精液常規(guī)分析參數(shù)在正常范圍之內(nèi);不育男性(年齡在25～40歲之間)指其配偶在沒有采取任何避孕措施情況下1～2年或2年以上沒有自然受孕的患者，并且其精液常規(guī)分析參數(shù)不在正常范圍之內(nèi)，包括畸形精子癥(正常形態(tài)%<15%)、弱精子癥[活力(a+b)%<50%)]和少精子癥(密度<20×106/mL)。經(jīng)浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院人類倫理委員會同意，生育組精液標(biāo)本(n?=20)是生育男性手淫法取得的精液標(biāo)本。不明原因性不育組(n?=25)精液標(biāo)本及不育組(n?=55)精液標(biāo)本均來自浙江大學(xué)附屬邵逸夫醫(yī)院生殖中心。每位患者都獲得知情權(quán)，并填寫了問卷調(diào)查以排除其他相關(guān)因素如年齡、工作條件、飲食習(xí)慣、吸煙情況、健康狀況。各型精液參數(shù)見表1。精液用PBS液離心(1?800 r/min，5 min)洗3次去除精漿后用4%多聚甲醛固定，4 ℃過夜備用。

　　1.2 方法

　　1.2.1 間接免疫熒光染色法：已固定的精液標(biāo)本用PBS液離心(1?800 r/min，5 min)洗3次后涂于硅烷化玻璃片上，并于室溫晾干。然后用0.1% TritonX-100/PBS破膜10 min，用PBS液洗3次(5 min/次)。隨后用10%的羊血清在室溫下封閉1 h。棄去封閉液，將CFTR抗體(1:500) 溶于10%羊血清中，加在玻片上，置于4 ℃濕盒中(防止玻片干燥)反應(yīng)過夜。第2天棄去一抗后用PBS液洗3次(10 min/次)，在避光環(huán)境下將二抗(Alex fluor 488交聯(lián)羊抗鼠，1:500)稀釋于10%羊血清中，加在玻片上，室溫孵育1 h。用PBS液洗3次(10 min/次)，DAPI(1μg/mL)或Hochest 33258(1μg/mL)染色10 min。然后用PBS洗3次(10 min/次)，吹干后在熒光顯微鏡(Nikon Eclipse 80i;Nikon Inc.，Tokyo，Japan)下觀察。觀察200個精子并計(jì)算CFTR在各類精子上的表達(dá)百分率。

　　1.2.2 精子膜蛋白的提?。簩⑷司訕?biāo)本用預(yù)冷PBS液離心(1?800 r/min，5 min)洗2次，棄上清，精子沉淀加入適量10% SDS膜蛋白裂解液(精子數(shù)不超過1×106 cells/mL)，用1 mL注射器(小號針頭)反復(fù)抽打裂解液(室溫)，直至液體不黏稠為止。離心(12?000 r/min，10 min)后，取上清，移入干凈Eppendorf管，置于37 ℃水浴中變性2 h后，加入2×上樣緩沖液，混勻，分裝，于-20 ℃冰箱保存。

　　1.2.3 蛋白印跡分析法：①SDS-PAGE的制備：安裝玻璃板，先制備15%分離膠10 mL。灌注分離膠至梳齒下1 cm，并在膠溶液上方覆蓋異丙醇，壓平凝膠，可見明顯分層，室溫下靜置45 min。待分離膠聚合完全后，制備5% PAGE積層膠5 mL，倒出異丙醇，灌注積層膠，并插入干凈的梳子，室溫下聚合30 min。將凝膠固定在電泳裝置上，電泳槽中加入1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液，然后移出梳子。②電泳：兩孔分別上樣20μg和40μg蛋白，并同時上樣5μL預(yù)染Marker(Bio-Rad，USA)。開始時電壓為80 V，待溴酚藍(lán)成一條線后，將電壓增加到100 V，直至Marker小分子蛋白明顯分離。③電轉(zhuǎn)：卸下玻璃板，去除多余凝膠。合適大小的PVDF膜先在甲醇溶液中浸泡30?s，移入1×電轉(zhuǎn)緩沖液平衡30 min。將凝膠與濾膜緊貼，兩側(cè)各貼上一層濾紙(Extra thick，Bio-Rad)，夾在多孔海綿中，裝置電轉(zhuǎn)槽，于碎冰中，電轉(zhuǎn)90 min(恒流200 mA)。④封閉：電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將PVDF印跡膜剪角標(biāo)記方向，用甲醇溶液浸泡30 s，再用TBS/T洗膜3次，每次10 min。然后放入封閉液中，水平搖床上室溫孵1 h。⑤一抗孵育：棄去封閉液，加入一抗溶液(CFTR，1:1?000;β-actin，1:1?000，用封閉液稀釋)，4 ℃搖床孵育過夜。棄去一抗溶液，用TBS/T溶液洗3次，每次10 min。⑥二抗孵育：加入二抗溶液(CFTR：辣根過氧化酶交聯(lián)的羊抗鼠IgG，1:1?000，β-actin：辣根過氧化酶交聯(lián)的羊抗鼠IgG，1:2?000)，室溫?fù)u床孵育1 h。棄去二抗溶液，用TBS/T溶液洗3次，每次10 min。⑨顯影：取ECL試劑A液、B液等體積混合，加在膜上反應(yīng)2 min后以保鮮膜包裹，壓在Kodak膠片上，暗盒曝光10 s～3 min。膠片浸入顯影液，一旦出現(xiàn)清晰條帶中止顯影。蒸餾水沖洗，浸入定影液1 min，自來水沖洗、晾干。

　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 精子CFTR表達(dá)率采用單因素方差分析及Dunnett’s post hoc test進(jìn)行檢驗(yàn)。

　　2 結(jié)果

　　2.1 CFTR在人精子中的表達(dá)及定位 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CFTR在人精子上有特異性表達(dá)，并定位于人精子頭部赤道板上如圖1(A)。另外，我們用蛋白印跡分析實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明人精子中存在CFTR蛋白，分子量為170 kD，兩個條帶的蛋白上樣量分別為20μg和40μg如圖1(B)。

　　2.2 CFTR在不同類型人精子上的表達(dá) 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CFTR在不同種類精子上的表達(dá)情況有顯著差異如圖2(A～C)。數(shù)200個精子計(jì)算表達(dá)率，結(jié)果顯示CFTR在生育組精子上的表達(dá)百分率與不明原因性不育組及不育組相比差異有顯著性。CFTR在生育組精子上的表達(dá)率(88.13%±3.79%)遠(yuǎn)高于不明原因性不育組(52.93%±15.36%)及不育組(35.89%±20.41%)(P?<0.01)如圖3，表明CFTR表達(dá)率下降與精子受精能力降低有關(guān)。

　　3 討論

　　CFTR是cAMP激活的陰離子通道，其基因突變能導(dǎo)致兩性不育[7-8]。我們以前的研究表明，CFTR表達(dá)在小鼠及人精子赤道板上，且其是小鼠和豚鼠精子獲能所必須的[6，9-10]。CFTR在人精子上的表達(dá)率是否與精子受精能力有關(guān)呢?研究顯示CFTR表達(dá)在人精子赤道板上，蛋白印跡分析實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明CFTR在人精子上有表達(dá)，分子量為170 kD，其結(jié)果與以前一致[6]。通過計(jì)數(shù)精子CFTR表達(dá)百分率，我們發(fā)現(xiàn)CFTR在生育組與不明原因性不育組及不育組(主要包括畸型精子癥、弱精子癥、少精子癥)精子上的表達(dá)百分率差異有顯著性，生育力正常的生育組精子的CFTR表達(dá)百分率明顯高于生育力下降的不明原因性不育組及不育組，表明精子CFTR表達(dá)率下降與精子受精能力降低有關(guān)。

　　精子功能正常與否對臨床選擇IVF還是ICSI治療不育癥極為重要。多年來，在科研及臨床工作中常用于判斷精子生殖力的指標(biāo)是精液常規(guī)分析，包括精液總量、液化時間、前向運(yùn)動精子百分率、活精率、畸形精子百分率及精子密度等。盡管精液常規(guī)分析在一定程度上反映了精子的生殖能力，然而只依靠精液常規(guī)分析的結(jié)果來預(yù)測男性生育狀況仍是很不準(zhǔn)確的[11]。例如本研究中的不明原因性不育組，精液常規(guī)分析參數(shù)是正常的，但其生育力是降低的，所以除了精液常規(guī)分析，需要更加可靠的指標(biāo)來反映精子受精能力。本研究表明，生育力正常的生育組精子的CFTR表達(dá)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于生育力下降的不明原因性不育組及不育組，證明了精子CFTR表達(dá)率下降與精子受精能力降低有關(guān)，因此CFTR表達(dá)率可能作為評價(jià)精子生殖能力的依據(jù)之一。

　　CFTR表達(dá)率具體與精子受精能力的哪一環(huán)節(jié)或哪幾個環(huán)節(jié)相關(guān)(獲能、頂體反應(yīng)還是精卵融合)?CFTR表達(dá)在精子赤道板上(赤道板是精子和卵子膜融合的部位)，那么CFTR表達(dá)率與IVF及ICSI成功率是否相關(guān)?這些都有待我們進(jìn)一步深入研究。

　　【參考文獻(xiàn)】

　　[1] Wong PY. CFTR gene and male fertility[J]. Mol Hum Reprod,1998,4(2):107-110.

　　[2] Cuppens H,Cassiman JJ.CFTR mutations and polymorphismsin male infertility[J]. Int J Androl, 2004,27(5):251-256.

　　[3] Meschede D, Dworniczak B, Behre HM, et al. CFTR genemutations in men with bilateral ejaculatory-duct obstruc-tion and anomalies of the seminal vesicles[J]. Am J HumGenet,1997,61(5):1200-1202.

　　[4] Le Lannou D, Jezequel P, Blayau M,et al.Obstructiveazoospermia with agenesis of vas deferens or with bron-chiectasia (Young's syndrome): a genetic approach[J]. HumReprod,1995,10(2):338-341.

　　[5] Van der Ven K, Messer L, van der Ven H, et al. Cystic fibrosismutation screening in healthy men with reduced spermquality[J].Hum Reprod,1996,11(3):513-517.

　　[6] Xu WM, Shi QX, Chen WY, et al. Cystic fibrosis transmem-brane conductance regulator is vital to sperm fertilizing ca-pacity and male fertility[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007,104(23):9816-9821.

　　[7] Quinton PM. Cystic fibrosis: a disease in electrolyte transport[J]. FASEB J,1990,4(10):2709-2717.

　　[8] Rowe SM, Miller S, Sorscher EJ. Cystic fibrosis[J]. N Engl JMed,2005,352(19):1992-2001.

　　[9] Wang XF, Zhou CX, Shi QX, et al. Involvement of CFTR inuterine bicarbonate secretion and the fertilizing capacity ofsperm[J].Nat Cell Biol,2003,5(10):902-906.

　　[10] Chen WY, Xu WM, Chen ZH, et al.Cl-is required for HCO3-entry necessary for sperm capacitation in guinea pig:in-volvement of a Cl-/HCO3-exchanger (SLC26A3) and CFTR[J].Biol Reprod,2009,80(1):115-123.

　　[11] Bostofte E, Serup J, Rebbe H. Interrelations among the char-acteristics of human semen, and a new system for classifica-tion of male infertility[J].Fertil Steril,1984,41(1):95-102.