RNA干擾Bcl2基因表達(dá)對人膽囊癌細(xì)胞株GBCSD裸

    細(xì)胞凋亡是機(jī)體重要的生理過程，凋亡調(diào)節(jié)紊亂有助于細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的進(jìn)展，因此研究凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制對于弄清腫瘤的發(fā)病機(jī)制及提供新的防治措施具有重要意義。Bcl2基因是一種抑制細(xì)胞凋亡的基因。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在多種惡性腫瘤組織中Bcl2基因均有高表達(dá)，膽囊癌亦不例外，提示Bcl2基因在膽囊癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用[1]。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年發(fā)展起來的一種基因沉寂技術(shù)，具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默作用，已廣泛用于抗腫瘤的研究中[2]。本課題以人膽囊癌GBCSD細(xì)胞系作為研究對象，以Bcl2基因作為靶基因，將針對Bcl2基因siRNA真核表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到人膽囊癌GBCSD細(xì)胞中后制作轉(zhuǎn)移瘤動(dòng)物模型系統(tǒng)，觀察其成瘤能力及腫瘤的生長情況;同時(shí)觀察針對Bcl2基因siRNA真核表達(dá)載體體內(nèi)局部注射抑制人膽囊癌GBCSD細(xì)胞裸鼠移植瘤的作用，從而為針對Bcl2基因的RNA干擾技術(shù)治療膽囊癌提供客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞及試劑 Bcl2 特異性siRNA表達(dá)載體pSilencerTMEGFP sh515(重組質(zhì)粒)和pSilencerTMEGFP shCon(空載體)由張勇、張岷博士惠贈(zèng)，第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室第四實(shí)驗(yàn)室保存;人膽囊癌細(xì)胞GBCSD細(xì)胞株由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室購買;脂質(zhì)體2000購于Sigma公司;兔抗人Bcl2多克隆抗體(AB1720)購自Chemicon公司。

　　1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4～6周齡的BALB/c裸鼠(18～22g)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(滬)20030003，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)飼養(yǎng)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 人膽囊癌細(xì)胞GBCSD的培養(yǎng) 人膽囊癌細(xì)胞貼壁生長于含10%(體積分?jǐn)?shù))新生小牛血清RPMI1640的培養(yǎng)液中，置37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待貼壁細(xì)胞密度生長至80%～90%后，按照1∶2比例傳代。

　　1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 人膽囊癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染前24h，將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化后按照每孔1×105細(xì)胞的密度重新接種6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24～48h，待貼壁細(xì)胞密度長至約90%時(shí)，進(jìn)行脂質(zhì)體2000介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染。每孔細(xì)胞，用250μL無血清培養(yǎng)液(RPMI 1640培養(yǎng)液)稀釋4.0μg DNA，輕輕震搖，使之充分混勻;用250μL RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋8μL lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕搖勻，5min內(nèi)與質(zhì)粒混合，搖勻，室溫放置20min。將6空板中的舊營養(yǎng)液吸出，用RPMI 1640培養(yǎng)液清洗兩遍，再加入2mL無血清培養(yǎng)基;將脂質(zhì)體DNA混合物加入6孔培養(yǎng)板中，輕輕混勻，置于孵箱37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)4～5h后，吸去培養(yǎng)液，加入含有10%(體積分?jǐn)?shù))新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置于孵箱培養(yǎng);48h后，加入160mL/L 潮霉素b及含10%(體積分?jǐn)?shù))新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)4～6周，收集單細(xì)胞集落，擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得抗性克隆細(xì)胞。

　　1.3.3 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn) ①成瘤能力實(shí)驗(yàn)。取10只4～6周的BALB/c裸鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為Bcl2 siRNA實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組：將siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞瘤的細(xì)胞懸液0.2mL，約6×106細(xì)胞/只，注入小鼠左后腋下皮下;對照組：在左后肢腋下種植人膽囊癌細(xì)胞GBCSD。②治療實(shí)驗(yàn)。取15只4～6周的BALB/c裸鼠，于右后肢腋下皮下分別接種6×106人膽囊癌細(xì)胞GBCSD/只，建立人膽囊癌GBCSD細(xì)胞裸鼠腫瘤模型。5～7d成瘤后按隨機(jī)數(shù)字表法將裸小鼠分為3組(n=5)：pSilencerTMEGFP sh515組(實(shí)驗(yàn)組)、pSilencerTMEGFP shCon組(空載體陰性對照組)及正常對照組。每隔2d，將10μg DNA重組質(zhì)粒pSilencerTMEGFP sh515和pSilencerTMEGFP shCon(陰性對照)分別與30μL Lipofectamine 2000脂質(zhì)體(Invitrogen)混勻，多點(diǎn)注射于實(shí)驗(yàn)組及空載體陰性對照組裸鼠瘤體周圍組織中，共注射5次。

　　1.3.4 移植瘤生長情況的觀察 每日觀察裸鼠的一般情況，每隔3d測量腫瘤大小，按公式：V= πa2b/6計(jì)算腫瘤體積(a：腫瘤短徑，b：腫瘤長徑)，測量計(jì)算生長率：平均生長率=平均腫瘤體積(mm)3/宿主帶瘤時(shí)間(d)，繪制注射細(xì)胞后腫瘤生長的曲線圖。6周后處死裸鼠，取出腫瘤，稱重，并切取肝、肺、脾、腎等組織，以10%(體積分?jǐn)?shù))甲醛溶液固定，石蠟包埋，切成4～5μm厚的切片。瘤體切片用于Bcl2基因表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色以判斷其表達(dá)情況;其余組織切片均行HE染色，以判斷有無轉(zhuǎn)移及。

　　1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 成瘤能力實(shí)驗(yàn)

　　2.1.1 移植瘤的生長情況 對照組和Bcl2 siRNA實(shí)驗(yàn)組成瘤率分別為和60%，瘤體平均體積分別為(1914.6±125.0)mm3和(629.7±78.9)mm3，平均生長率分別為45.586%和14.99%，瘤體平均重量分別為(2.24±0.33)g和(0.77±0.12)g。對照組瘤體的平均體積、平均生長率、平均重量明顯大于Bcl2 siRNA細(xì)胞組(P<0.05，圖1)。

　　2.1.2 組織病理學(xué)變化 裸鼠不同組織的HE染色結(jié)果表明，除裸鼠瘤體組織有壞死外，其余各部分組織形態(tài)正常。免疫組化染色顯示，對照組染色信號(hào)較強(qiáng)，陽性表達(dá)率為(50.4±1.3)%;Bcl2 siRNA實(shí)驗(yàn)組染色信號(hào)較對照組信號(hào)為弱，陽性表達(dá)率為(28.2±2.1)%，兩組比較后者顯著降低(P<0.05，圖2)。

　　2.2 治療實(shí)驗(yàn)

　　2.2.1 移植瘤的生長情況 實(shí)驗(yàn)組瘤體平均體積、平均生長率、平均瘤體重量明顯小于空載體陰性對照組和正常對照組(P<0.05)，空載體陰性對照組和正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1、圖3)。 表1 各組瘤體的平均體積、平均生長率和平均瘤體重量的比較

　　2.2.2 組織病理學(xué)變化 裸鼠各組織的HE染色表明，除裸鼠瘤體組織有壞死外，其余各部分組織形態(tài)正常。免疫組化染色顯示，空載體陰性對照組和對照組瘤體Bcl2陽性表達(dá)率分別為(51.2±2.3)%，(53.0±1.7)%，兩者比較無顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組染色信號(hào)弱，Bcl2陽性表達(dá)率為(34.5±2.8)%，顯著低于其他兩組 (P<0.05)。

　　3 討 論

　　近年來分子生物學(xué)研究表明，原發(fā)性膽囊癌為多基因、遺傳、環(huán)境致癌因素等誘導(dǎo)下綜合作用的結(jié)果，細(xì)胞凋亡在膽囊腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。Bcl2基因是細(xì)胞凋亡中重要的調(diào)節(jié)因子之一。研究發(fā)現(xiàn)在膽囊癌中Bcl2基因有高表達(dá)。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是近年來產(chǎn)生的新興生物技術(shù)，能夠作為一種簡單、有效的代替基因敲除的遺傳工具。RNAi技術(shù)已開始應(yīng)用于多種惡性腫瘤的基因治療中，如在慢性淋巴瘤、乳腺癌等腫瘤中取得了較好的效果，但在膽囊癌的治療中尚處于實(shí)驗(yàn)階段。因此，研究RNAi技術(shù)在膽囊癌中的作用將有助于為膽囊癌的基因治療提供理論依據(jù)。

　　本研究的成瘤能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在體外進(jìn)行以Bcl2為靶點(diǎn)的干擾可以顯著降低人膽囊癌GBCSD細(xì)胞的增殖能力，導(dǎo)致細(xì)胞的成瘤能力顯著下降，已成瘤的生長能力下降?；蛑委煂?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，針對Bcl2基因siRNA真核表達(dá)載體的重組質(zhì)粒組體內(nèi)局部注射可以一定程度地抑制人膽囊癌GBCSD細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長。

　　本研究采用裸鼠皮下構(gòu)建膽囊癌模型。我們之所以采用6～8周齡的BALB/c健康裸鼠，是為了避免隨著裸鼠年齡增長或有關(guān)因素的影響，裸鼠體內(nèi)正常免疫系統(tǒng)會(huì)增強(qiáng)而影響接種成功率。另外，裸鼠雖無T淋巴細(xì)胞，但仍有免疫球蛋白、自然殺傷細(xì)胞、吞噬細(xì)胞等，隨著裸鼠成熟或在感染情況下，這類免疫功能將成熟或被激活，使接種成功率降低。本實(shí)驗(yàn)利用人膽囊癌GBCSD細(xì)胞系接種裸鼠皮下，移植瘤成功率達(dá)到，也提示了膽囊癌的高度惡性和有較強(qiáng)的成瘤能力。

　　許多研究表明，以腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒及慢病毒為載體的體內(nèi)治療可以獲得滿意的效果[3]。這種表達(dá)的載體能夠注射到局部，并高效地轉(zhuǎn)染細(xì)胞，但病毒載體能引起有害的免疫反應(yīng)，比直接注射具有更大的風(fēng)險(xiǎn)。質(zhì)粒是早被用來向細(xì)胞內(nèi)引入siRNA表達(dá)框的載體，由于其構(gòu)建相對簡單，在研究中被廣泛采用。然而由于其對部分類型細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較低，限制了其在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。在本實(shí)驗(yàn)中，我們用脂質(zhì)體介導(dǎo)的裸鼠移植瘤重組質(zhì)粒的多點(diǎn)注射也可以達(dá)到一定程度的基因沉默效果。由此可見，體外實(shí)驗(yàn)中有效的脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染同樣在一定程度上可以應(yīng)用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。SORENSEN等[4]向腹腔內(nèi)注射脂質(zhì)體包裹的siRNA可以有效地預(yù)防細(xì)菌產(chǎn)生的脂多糖類物質(zhì)所引起的敗血癥。ZHANG等[5]通過靜脈內(nèi)注射免疫脂質(zhì)體來傳送siRNA可以起到對特定類型細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。

　　另外，在裸鼠體內(nèi)形成人膽囊癌GBCSD細(xì)胞瘤模型后，自瘤內(nèi)及瘤周注射siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物時(shí)，為試圖克服siRNA體內(nèi)易降解的缺點(diǎn)，我們采用了多次注射的方法。但實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比，質(zhì)粒載體表達(dá)的siRNA雖能使人膽囊癌GBCSD細(xì)胞裸鼠移植瘤生長速度減慢，但腫瘤生長率仍很高;雖能使Bcl2的表達(dá)減少，但減少的程度非常有限，腫瘤細(xì)胞仍有較高水平Bcl2表達(dá)，并且其表達(dá)水平是否會(huì)因傳染后時(shí)間的長短而有所改變以及如何改變，在本實(shí)驗(yàn)中并未涉及。因此，如何使siRNA的轉(zhuǎn)染更加高效，探索更加適宜的轉(zhuǎn)染載體、轉(zhuǎn)染途徑、轉(zhuǎn)染時(shí)機(jī)是需要我們進(jìn)一步研究的內(nèi)容。

　　總之，本研究應(yīng)用RNAi技術(shù)，干擾Bcl2基因?qū)θ四懩野〨BCSD細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)影響，在國內(nèi)尚未見報(bào)道。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，以Bcl2基因?yàn)榘谢颍ㄟ^RNAi技術(shù)沉默此基因，可以使人膽囊癌GBCSD細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力下降，生長減慢。這一結(jié)論為膽囊癌的基因治療提供一個(gè)新的研究方向。