神經(jīng)凝膠復(fù)合嗅鞘細(xì)胞移植修復(fù)大鼠脊髓橫斷傷的實(shí)驗(yàn)研究

作者：劉吉祥，吳 鋒，任洪波，張素蘭，劉 斌 作者單位：056001 河北邯鄲，邯鄲市中心醫(yī)院神經(jīng)外一科

　　【關(guān)鍵詞】 神經(jīng)凝膠復(fù)合嗅鞘細(xì)胞移植 大鼠 脊髓橫斷傷 實(shí)驗(yàn)研究

　　脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)后神經(jīng)再生和肢體功能恢復(fù)一直困擾醫(yī)學(xué)臨床的一大難題。近年來，隨著神經(jīng)細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、神經(jīng)電生理學(xué)、神經(jīng)移植等技術(shù)和組織工程材料的飛速發(fā)展，人們對(duì)損傷后神經(jīng)軸突再生及其調(diào)控有了深入的了解，但對(duì)脊髓完全性橫斷傷后神經(jīng)再生和肢功能恢復(fù)并沒有取得突破性進(jìn)展。近年來逐漸興起的神經(jīng)凝膠(neurogel，NG)[1~4]為利用神經(jīng)生物工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)脊髓完全性橫斷傷后神經(jīng)再生和肢體功能恢復(fù)帶來了新的希望，其有效性、安全性和可行性等方面已經(jīng)取得了明確結(jié)論，并已作為商品投放科研市場;同樣對(duì)嗅鞘細(xì)胞(OECs)促進(jìn)損傷后神經(jīng)細(xì)胞存活和軸突再生也已得到充分證實(shí)[5~8]。本研究擬以NG為支架，使高度純化的OECs在其表面粘附、生長，構(gòu)建NG-OECs復(fù)合體移植修復(fù)大鼠脊髓橫斷損傷，以觀察和分析其對(duì)神經(jīng)元存活和神經(jīng)軸突再生的作用和意義。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　DMEM-F12(DF12)培養(yǎng)基購自Hyclone公司，小牛血清(NCS)、胰蛋白酶購自Gibico公司，hoechst33342、多聚賴氨1093酸(PLL)購自Sigma公司，P75抗體、EnVision試劑盒購自Dako公司(單克隆抗人抗體)、NF-200、Synaptophysin(多克隆抗體)抗體及DAB顯色試劑盒均購自博士德公司。成年雌性Wistar大鼠60只，重250～300g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

　　1.2 OECs的取材、分離

　　OECs的分離、培養(yǎng)、純化和標(biāo)記：取2.5個(gè)月齡雌性Wistar大鼠的嗅球神經(jīng)層及顆粒層;以0.25%胰蛋白酶消化，終止消化后用含20%胎牛血清的DF12培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液，接種于未涂膠的玻璃培養(yǎng)瓶，置5%CO2孵箱37℃培養(yǎng)12h后將培養(yǎng)上清連同未貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)種于另一個(gè)未涂膠的玻璃培養(yǎng)瓶，再培養(yǎng)12h;調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，種植于經(jīng)poly-L-Lysine處理的6孔板，培養(yǎng)7天，加入Ara-C(終濃度為10-5mol/L)作用48h，清洗后培養(yǎng)液中添加forskolin和BPE(終濃度分別為20μmol/L和20μg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)10天左右，行S-100常規(guī)免疫組化染色以確定純度。細(xì)胞移植前培養(yǎng)液中加入BrdU孵育48h(作用濃度5μmol/L)。

　　1.3 OECs免疫細(xì)胞化學(xué)染色及純度鑒定

　　將獲得的OECs分別在原代分離后第2、7、14天做P75免疫細(xì)胞化學(xué)染色。取出6孔板內(nèi)蓋玻片，放入40g/L多聚甲醛室溫下固定40min，PBS沖洗3次，加入封閉血清，室溫下作用20min，PBS沖洗后，按DAKO公司提供EnVision工作程序加入P75抗體(抗人單抗)及其他試劑。顯微鏡觀察，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取3個(gè)視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞并計(jì)算平均陽性百分率。

　　1.4 構(gòu)建NG-OECs復(fù)合體

　　篩選合適的細(xì)胞密度，利用微注射技術(shù)將OECs順柱形NG主孔方向注入，與NG支架共培養(yǎng)，并利用光鏡及電鏡觀察細(xì)胞在支架中的形態(tài)特點(diǎn)及生物學(xué)特性。

　　1.5 脊髓神經(jīng)元與NG-OECs復(fù)合體共培養(yǎng)

　　取胎齡E16的大鼠脊髓神經(jīng)元微注射法沿主孔方向接種于無血清培養(yǎng)NG-OECs復(fù)合體中，另將其接種于無OECs的NG中作為對(duì)照組。分別于接種后1、3、5、7、14天觀察神經(jīng)元生長情況。以NF-160抗體為一抗，進(jìn)行細(xì)胞免疫組化染色，觀察脊髓神經(jīng)元的存活情況。用免疫熒光、免疫電鏡等方法檢測OECs與脊髓神經(jīng)元體外共培養(yǎng)時(shí)生長整合情況。

　　1.6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

　　實(shí)驗(yàn)擬用雌性Wistar大鼠60只，分為單純損傷和NG-OECs復(fù)合體移植兩組，每組30只。

　　1.7 大鼠脊髓橫斷性損傷模型

　　按40mg/kg劑量麻醉大鼠，麻醉后固定于立體定向儀上，以T10為中心，設(shè)計(jì)切口。在顯微鏡下，無菌操作切除T10全椎板及T9、T11部分椎板，顯露脊髓，剪開硬膜，以特制探針橫預(yù)置3-0絲線于待損傷脊髓腹側(cè)硬膜內(nèi)。以剃須刀片于預(yù)置線頭側(cè)0.5mm(T9水平)將脊髓橫斷，順利由腹側(cè)向背側(cè)提出預(yù)置線，明膠海綿輕柔壓迫止血。移植后縫合硬膜及切口。

　　1.8 NG-OECs移植

　　各組分別于損傷后即時(shí)采用顯微外科技術(shù)將構(gòu)建好的NG-OECs復(fù)合體移植于脊髓斷端，標(biāo)準(zhǔn)化操作。OECs對(duì)照組使用顯微注射法將OECs懸液10μl(107/ml)注入距傷部3mm脊髓兩斷端處，留針10min后緩慢拔針。

　　1.9 脊髓神經(jīng)功能恢復(fù)情況的評(píng)價(jià)

　　行為學(xué)評(píng)分：2組均于移植后1、2、3、4、6周及8周進(jìn)行行為學(xué)檢查，采用雙盲法進(jìn)行大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分(BBB記分法)，21分為功能正常，0分為功能完全喪失。BBB評(píng)分觀察時(shí)間為5min。

　　1.10 脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)重建情況評(píng)價(jià)

　　應(yīng)用組織學(xué)染色、免疫組化等方法評(píng)價(jià)脊髓損傷的結(jié)構(gòu)重建情況，利用神經(jīng)電生理和BBB評(píng)分觀察其功能恢復(fù)情況。(1)組織切片病理染色觀察各組脊髓損傷區(qū)神經(jīng)纖維與膠質(zhì)瘢痕生成情況，應(yīng)用HE、FB和Holzer等染色方法。(2)超薄切片電鏡觀察再生神經(jīng)纖維生長與延伸情況、再生纖維與OECs整合及突觸形成等超微結(jié)構(gòu)。

　　1.11 NG-OECs復(fù)合體移植技術(shù)的安全性檢測

　　(1)免疫組織化學(xué)(NGFR、GFAP、BrdU)和免疫熒光技術(shù)檢測細(xì)胞增殖分化狀態(tài)及遷移情況。(2)移植細(xì)胞成瘤性檢測：利用移植后長時(shí)間(大于半年)存活的動(dòng)物，觀察移植細(xì)胞是否具有異型性。

　　1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

　　根據(jù)每一實(shí)驗(yàn)步驟取得的結(jié)果數(shù)據(jù)形式，應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較采用t檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有顯著性。

　　2 結(jié)果

　　2.1 BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分

　　所有大鼠脊髓全橫斷后第1、2周的BBB評(píng)分均為0分;傷后3周實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組后肢運(yùn)動(dòng)功能有輕微恢復(fù);細(xì)胞移植4周后，NG-OECs復(fù)合體移植組BBB評(píng)分明顯高于對(duì)照組，差異有顯著性(P<0.05)。6周后，NG-OECs復(fù)合體移植組BBB評(píng)分提高更為顯著，且兩組BBB評(píng)分差值有增大趨勢，提示NG-OECs復(fù)合體移植可能對(duì)SCI大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)有促進(jìn)作用(表1)。

　　2.2 組織學(xué)觀察

　　術(shù)后3周脊髓損傷區(qū)蘇木精-伊紅染色顯示NG-OECs復(fù)合體移植組脊髓損傷區(qū)結(jié)構(gòu)紊亂，纖維走行方向扭曲、不一致，細(xì)胞數(shù)目較多，嗜銀染色結(jié)果顯示無論在損傷區(qū)還是損傷頭、尾端，NG-OECs復(fù)合體移植組神經(jīng)纖維數(shù)量多于對(duì)照組。NG-OECs復(fù)合體移植組損傷頭端神經(jīng)纖維數(shù)量多于損傷尾端，對(duì)照組損傷頭、尾端神經(jīng)纖維數(shù)量基本一致。利用圖像分析系統(tǒng)對(duì)嗅鞘細(xì)胞移植組、對(duì)照組脊髓損傷區(qū)和對(duì)照組相同節(jié)段CST區(qū)域嗜銀染色進(jìn)行神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)，其結(jié)果見表1。表1 NG-OECs組和對(duì)照組各階段BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分結(jié)果

　　2.3 NG-OECs復(fù)合體移植修復(fù)脊髓損傷超微結(jié)構(gòu)觀察

　　術(shù)后3周臨近脊髓損傷區(qū)近端的脊髓前、后角取出組織透射電鏡觀察可見，NG-OECs復(fù)合體移植組脊髓有較多增生組織填充，脊髓組織中無明顯空腔，空泡小而少，神經(jīng)纖維及細(xì)胞壞死較少，色澤較亮;而對(duì)照組有較多空腔狀，白質(zhì)中有許多微囊，神經(jīng)纖維及細(xì)胞壞死，顏色較暗，在橫斷處附近形成較多空泡;8周時(shí)上述差別更明顯。

　　2.4 脊髓組織切片的熒光觀察和免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

　　冰凍切片熒光顯微鏡下表現(xiàn)，NG-OECs復(fù)合體實(shí)驗(yàn)組：3周標(biāo)本，hoechst標(biāo)記的OECs多集中于注射部位，熒光比較強(qiáng);6周后熒光強(qiáng)度漸弱和密度降低(對(duì)比3周)，細(xì)胞可遷移至原注射部位15～3.5mm遠(yuǎn)處，提示細(xì)胞移植后向周圍遷移。對(duì)照組為陰性。移植細(xì)胞成瘤性檢測：利用移植后長時(shí)間(大于半年)存活的動(dòng)物，采集20只，在電鏡下觀察移植OECs均未發(fā)現(xiàn)明顯異型性。

　　3 討論

　　傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，哺乳動(dòng)物的腦和脊髓損傷后不能再生，因而半癱或全癱癥狀如果不能在傷后24h內(nèi)得到改善，則不會(huì)有明顯的功能恢復(fù)。近，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)CNS有再生功能，神經(jīng)損傷后的修復(fù)能力取決于多種因素的影響。目前認(rèn)為脊髓損傷后難以恢復(fù)的主要原因包括：(1)對(duì)脊髓的直接打擊及繼發(fā)炎癥使脊髓內(nèi)功能神經(jīng)元大量壞死，右旋糖苷生物素順行標(biāo)記顯示：再生的皮質(zhì)脊髓束損傷凋亡且神經(jīng)元再生困難;(2)脊髓損傷后暴露的髓鞘相關(guān)抑制分子及繼發(fā)形成的膠質(zhì)瘢痕阻礙了軸突的生長和正確連入灰質(zhì)形成終末分支。(3)損傷造成局部細(xì)胞凋亡，致使細(xì)胞分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子減少，破壞了支持軸突再生的有利微環(huán)境[9]。本實(shí)驗(yàn)中觀察到：傷后3周實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組后肢運(yùn)動(dòng)功能有輕微恢復(fù);細(xì)胞移植4周后，NG-OECs復(fù)合體移植組BBB評(píng)分明顯高于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。6周后，NG-OECs復(fù)合體移植組BBB評(píng)分提高更為顯著，且兩組BBB評(píng)分差值有增大趨勢，提示NG-OECs復(fù)合體移植可能對(duì)SCI大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)有促進(jìn)作用(表1)。組織學(xué)方面對(duì)嗅鞘細(xì)胞移植組、對(duì)照組脊髓損傷區(qū)和對(duì)照組相同節(jié)段CST區(qū)域嗜銀染色進(jìn)行神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)，其結(jié)果為NG-OECs復(fù)合體移植組(544.7±102.2)，對(duì)照組(2212.8±175.4)。兩組之間差異有顯著性(P<0.05)。這也與實(shí)驗(yàn)中BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分所得到結(jié)果相符。細(xì)胞移植后3周左右，注射部位可檢測到強(qiáng)而且密集的藍(lán)色熒光;6周后檢測到熒光強(qiáng)度漸弱和密度降低但分布更為廣泛。提示細(xì)胞由注射部位向周圍緩慢遷移，部分細(xì)胞甚至越過損傷頭尾兩端(P75染色)，遷移至原注射部位1.5~3.5mm遠(yuǎn)處，在遷移過程中和周圍組織逐漸融合并發(fā)揮支持作用。筆者認(rèn)為移植的NG-OECs復(fù)合體在脊髓損傷修復(fù)過程中可能發(fā)揮如下作用：(1)支持脊髓神經(jīng)元軸突再生和突觸重建。嗅神經(jīng)終身可以再生，并且再生軸突可穿越周圍神經(jīng)系統(tǒng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的交接區(qū)，重新長入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嗅球并建立起突觸聯(lián)系，嗅神經(jīng)元(olfactory sensory neumns，OSNs)的強(qiáng)再生能力與嗅覺系統(tǒng)內(nèi)嗅鞘細(xì)胞的獨(dú)特作用密不可分，OECs包被著嗅神經(jīng)軸突，并且誘導(dǎo)嗅神經(jīng)長入神經(jīng)中樞，決定了OsNs軸突終身再生的生理特性;(2)OECs能表達(dá)多種細(xì)胞表面粘附分子，如層粘連蛋白(1aminin)、細(xì)胞粘連分子LI(cell adhesion molecule)等促進(jìn)神經(jīng)軸突生長;(3)OECs還能分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，如神經(jīng)營養(yǎng)素(NT-3)、神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)等，這些神經(jīng)營養(yǎng)因子對(duì)于神經(jīng)元的成熟具有促進(jìn)作用。臨床上，脊髓損傷患者中橫斷傷療效差，筆者的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c其相吻合：因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床脊髓損傷患者嗅鞘細(xì)胞移植后的神經(jīng)功能恢復(fù)，從理論上奠定了基礎(chǔ)、提供了依據(jù)。結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究筆者認(rèn)為，嗅鞘細(xì)胞移植后，脊髓損傷晚期患者神經(jīng)功能恢復(fù)的機(jī)制在早期可能以脫髓鞘后髓鞘化等損傷修復(fù)作用為主，隨后可能兼有損傷修復(fù)和神經(jīng)再生兩方面的作用，后則可能以神經(jīng)再生的作用為主。