莪術油對人乳腺癌MCF7細胞凋亡及Bcl2、Bax表達的影響

     作者：楊麗華 姜 杰 作者單位：廈門大學醫(yī)學院 廈門 361005 福建省廈門市衛(wèi)生局

　　【摘要】 目的：觀察中藥提取物莪術油(zedoray turmeric oil)對人乳腺癌(human breast cancer)細胞系MCF7的凋亡誘導作用。方法：用不同濃度的莪術油對體外培養(yǎng)的MCF7細胞進行干預。分別采用MTT、細胞免疫組織化學染色、流式細胞儀檢測等方法，觀察其對MCF7細胞增殖的抑制和凋亡誘導作用，并對凋亡相關Bcl2與Bax蛋白的表達變化進行定性檢測。結果：經不同濃度的莪術油處理后的MCF7細胞，其生長受到明顯的抑制，細胞凋亡指數隨藥物濃度增加而明顯增加;莪術油作用后，細胞中Bax蛋白表達明顯高于對照組。結論：一定濃度的莪術油能抑制MCF7細胞增殖，促進其凋亡;其機制可能與調控Bcl2、Bax 表達有關。

　　【關鍵詞】 乳腺癌 莪術油 MCF7細胞 Bcl2 Bax

　　Abstract ob[x]jective:To investigate the effects of Zedoray Turmeric Oil on inducing apoptosis of MCF7 cells and to explore the possible mechanism of its action.Methods:Different concentrations of Zedoray Turmeric Oil were used in the culture system of MCF7 cells.Proliferation and apoptosis of MCF7 cells were observed by ways of MTT,immunocytochemistry,and flow cytometry quantitative analysis.The ex[x]pression of Bcl2 and Bax protein was determined by qualitative analysis.Results:Proliferation of MCF7 cells was inhibited effectively after being treated by different concentrations of Zedoray Turmeric Oil.The rate of apoptosis increased as the increase in the concentration of Zedoray Turmeric Oil.The ex[x]pression of Bcl2 was decreased in the experimental groups,whilethe ex[x]pression of Bax protein was significantly higher than that the control group.Conclusion:Zedoray Turmeric Oil can effectively inhibit proliferation of and promote apoptosis of MCF7 cells; the mechanism may be correlated to the up regulation of Bax and down regulation of Bcl2.

　　Key words breast cancer Zedoray Turmeric Oil MCF7 Bcl2 Bax

　　莪術是我國傳統(tǒng)中藥之一， 是姜科草本植物莪術、 郁金的根莖， 味辛、 苦， 性溫， 歸肝、 脾經， 具有行氣破血、 消積止痛的功效。 莪術油(zedoary turmeric oil)是莪術中提取的揮發(fā)油， 含有多種抗腫瘤有效成分。 對多種實體腫瘤(如子宮內膜癌、 宮頸癌、 白血病、 肺癌、 肝癌、 結腸癌、 乳腺癌等)有較強的抑制作用[1]， 而且具有抗血栓、 抗病毒、 抗菌和增強免疫等功能[24]。 張瑾峰等[5]發(fā)現(xiàn)， 莪術與三棱聯(lián)合應用具有誘導乳腺癌細胞凋亡的作用。 本研究通過一定濃度的莪術油作用乳腺癌細胞系MCF7后， 觀察其對MCF7細胞的凋亡誘導效應， 并通過對與凋亡相關的Bcl2和Bax蛋白表達變化的檢測， 探討莪術油對MCF7細胞凋亡誘導的作用機制。

　　材料與方法

　　1.1 材料及儀器

　　人乳腺癌MCF7細胞株(廈門大學生命科學學院提供)。莪術油注射液(徐州萊恩藥業(yè)有限公司，國藥準字：H20067076)，配制為20g/L的無菌溶液備用。RPMI 1640、二甲基亞砜(DMSO)、胎牛血清、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(MTT)(北京中杉金橋生物技術有限公司)。鼠抗人Bcl2、Bax單克隆抗體及SP免疫組化試劑盒(福州邁新生物技術開發(fā)有限公司)。流式細胞儀(美國GENE公司)。實驗時選用對數生長期細胞。

　　1.2 MTT法生長曲線測定

　　取對數生長期的MCF7細胞，消化后制成細胞懸液，調整細胞濃度為1×104 個/ml， 接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔加200μl細胞懸液，培養(yǎng)24小時后，加入不同濃度的莪術油(0.15、0.25、0.35、0.50、1.0mg/ml)，另設對照組(不加莪術油)和空白對照組(只加培養(yǎng)基)，每組設 7個復孔，分別于加藥后1、2、3、4、5、6、7、8和9天時加MTT(5mg/ml)20μl，孵育4小時后，加入二甲基亞砜200μl，避光振蕩10min，酶標儀在570nm處測定各孔吸光度(OD)值，取平均值，以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制細胞生長曲線。

　　1.3 流式細胞儀檢測凋亡

　　不同濃度的莪術油(0.15、0.25、0.35、0.50、1.0mg/ml)分別作用于貼壁生長的MCF7細胞72小時后，胰酶消化，吹打脫落，使細胞分散良好，1500r/min離心5min，棄上清，加 1×緩沖液200μl。各管中分別加入AnexinV 4μl和PI 5μl，用1×緩沖液將終體積配成250μl， 冰浴，上機檢查。以不加莪術油培養(yǎng)72小時的MCF7細胞作為陰性對照。

　　1.4 免疫細胞化學染色

　　將對數生長期的MCF7細胞6瓶(細胞數>1×105/瓶)隨機分為對照組和實驗組， 每組3瓶。實驗組用含0.35mg/ml莪術油的培養(yǎng)基培養(yǎng)，對照組正常培養(yǎng)，48小時后終止培養(yǎng)。隨機從對照組和實驗組各取1瓶細胞，用0.2%胰酶消化后收集細胞，做細胞涂片。4℃丙酮固定20min，1XPBS洗3次，每次5min。自然干燥后，按PV9000試劑盒要求，行Bcl2和Bax免疫細胞化學染色，并分別設立陰性與陽性對照。結果判定：Bcl2和Bax陽性細胞為胞質染為黃色或棕黃色，陰性細胞均不著色。通過染色強弱，觀察兩種蛋白表達改變的趨勢。

　　1.5 統(tǒng)計學方法

　　應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，計量資料用(±s)表示，t檢驗，P<0.05為顯著性檢驗水準。

　　2 結 果

　　2.1 莪術油對MCF

　　7細胞形態(tài)變化的影響 實驗組細胞在加藥后24小時，倒置顯微鏡下觀察，可見大部分細胞由梭形變?yōu)椴灰?guī)則形，胞體增大，胞內可見大小不等的空泡樣結構，細胞核邊移，但大部分細胞膜尚完整，尤以1.0mg/ml組細胞形態(tài)變化明顯，并且細胞數量與對照組比較明顯減少，同時有許多細胞漂浮，不貼壁。

　　2.2 莪術油對MCF

　　7細胞生長的影響 根據酶標儀所測的不同時間及不同濃度莪術油作用后的 OD值繪制MCF7細胞生長曲線。從該生長曲線可見，MCF7細胞經5種不同濃度的莪術油處理后，細胞生長受到不同程度的抑制，以1.0mg/ml組的抑制作用強，見圖1。圖1 MCF7細胞生長曲線2.3 對細胞凋亡率的影響 不同濃度(0.15、0.25、0.35、0.50、1.0mg/ml)的莪術油作用于MCF7細胞72小時后，上機檢測，流式細胞儀作出細胞DNA含量分布圖，計算機軟件自動擬合出凋亡指數(%)。對照組凋亡指數為4.53%， 實驗組分別為10.17%、17.10%、23.15%、26.43%和30.12%。隨藥物濃度增加，細胞凋亡指數呈上升趨勢。

　　2.4 細胞免疫組織化學染色結果

　　Bcl2染色顯示，對照組細胞漿濃染呈棕黃色，實驗組細胞漿著色明顯減弱，呈淡黃色，個別細胞甚至呈陰性。Bax染色顯示，對照組細胞漿染色呈淡黃色，實驗組細胞漿著色則明顯增強，尤以核周明顯，黃染加重。

　　3 討 論

　　文獻報道[1]，一定濃度的莪術油在體外可誘導人子宮內膜癌RL952細胞，肝癌SMMC7721細胞、胃癌NKM45細胞、肺癌SPCA4細胞和肝癌細胞HepG2細胞凋亡，且其誘導凋亡的作用隨莪術油的濃度增加而增加。蒲磊等[6]研究表明，莪術油可抑制乳腺癌MCF7細胞增殖，促進細胞凋亡，其機制可能與上調Fas蛋白、下調FasL蛋白表達有關。

　　本研究用0.15～1.0mg/L的莪術油作用乳腺癌細胞株(MCF7)1～8天后，細胞生長受到不同程度的抑制。從MTT的實驗結果看，0.15mg/ml濃度的莪術油對MCF7細胞的增殖抑制作用不明顯，而0.35mg/ml及更高濃度的莪術油則可使細胞增殖受到明顯抑制，且隨著作用濃度的增高和作用時間的延長，細胞增殖受抑制更為明顯，提示莪術油對MCF7細胞的增殖有抑制作用，而且呈時間和濃度依賴性。用不同濃度的莪術油分別作用 MCF7細胞72小時后，細胞凋亡率檢測發(fā)現(xiàn)，在藥物濃度為0.35mg/L，即有明顯的細胞凋亡發(fā)生，隨藥物濃度的增加，細胞凋亡率呈上升趨勢;并且在藥物濃度為0.35mg/L時， 凋亡率已達23.15%。由此提示，莪術油在體外具有抑制MCF7細胞生長增殖、誘導凋亡的作用，且這一作用隨藥物作用的濃度增加而增加。根據生長曲線計算，莪術油對MCF7細胞的半數有效量在0.325mg/L左右。研究結果顯示，莪術油能下調MCF7細胞的Bcl2表達，同時上調Bax的表達，兩種蛋白比例發(fā)生明顯變化。結合細胞凋亡率檢測結果推測，莪術油誘導MCF7細胞凋亡可能與其改變凋亡相關蛋白Bcl2/Bax的表達有關。

　　以上結果提示,莪術油在體外對MCF7的生長增殖有明顯抑制作用，同時誘導該細胞凋亡，有可能是一種有希望的抗腫瘤中藥。其作用機制可能與莪術油調控MCF7細胞的凋亡相關基因Bcl2/Bax的表達有關，而不是單純的細胞毒性壞死。