血管內(nèi)皮生長因子165基因?qū)θ宋赴┘?xì)胞侵襲性的影響

    作者：樂紅琴,歐希龍,杭程,陳慧娟　　作者單位：.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鹽城醫(yī)院 消化內(nèi)科，江蘇 鹽城 224001;2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 消化內(nèi)科，江蘇 南京 210009
    胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移和腹膜種植轉(zhuǎn)移是其常見的轉(zhuǎn)移方式,預(yù)后較差。闡明胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制,可以為胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的早期診斷和靶向治療提供理論基礎(chǔ)。近年來人們已經(jīng)在人和動物的胃癌組織中發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的過度表達(dá),且其過度表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。為進(jìn)一步了解VEGF能否通過自分泌途徑增強(qiáng)胃癌細(xì)胞BGC823的侵襲力及其機(jī)制，故設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞BGC823，觀察BGC823轉(zhuǎn)染VEGF165對其遷移能力及對侵襲相關(guān)分子基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix me[x]talloproteinases2，MMP2)、尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinasetype plasminogen activator，uPA)分泌的影響，旨在進(jìn)一步探討VEGF在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及可能機(jī)制，對胃癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的早期診斷及靶向治療有重要意義。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　人胃腺癌細(xì)胞株BGC823購自中國科學(xué)院，復(fù)制缺陷型腺病毒(Ad)重組體AdVEGF165及對照病毒Ad綠色熒光蛋白(GFP)由南京醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院構(gòu)建并贈送，RPMI 1640低糖培養(yǎng)基購自美國Gibco brl公司，胎牛血清購自杭州四季青公司。Trizol試劑及RTPCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，PCR引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) BGC823用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化后進(jìn)行傳代，一般1～2 d傳1代，1瓶接種2至3瓶，隔日更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

　　1.2.2 病毒轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分成對照組、AdGFP組和AdVEGF165組等3組，以細(xì)胞濃度為2.0×105 ml-1分別取3 ml接種于3個(gè)培養(yǎng)瓶(50 ml)中，于60%～70%細(xì)胞貼壁時(shí)吸出原培養(yǎng)液，對照組加入無血清無抗生素RPMI 1640培養(yǎng)液3 ml，后兩組加入相應(yīng)的無血清無抗生素RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋的病毒液3 ml轉(zhuǎn)染[在前期試驗(yàn)中已經(jīng)測得Ad的感染復(fù)數(shù)(MOI)值在20的時(shí)候達(dá)到佳的感染效果，本實(shí)驗(yàn)MOI值與前期實(shí)驗(yàn)相同]。8 h后換含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)36 h，對轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞行部分生物學(xué)特性研究。

　　1.2.3 Millicell小室細(xì)胞體外遷移實(shí)驗(yàn) 分別收集對照組、AdGFP組和AdVEGF165組細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后,使用無胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為1×105 ml-1。將Millicell小室放入6孔板中，下室中加入1 600 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)液,上室加入無胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋的單細(xì)胞懸液100 μl,每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔,置于37 ℃、5%CO2 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，取出濾膜,用95%酒精固定細(xì)胞，然后行HE染色，輕輕用棉簽擦凈小室上室面無侵襲性的細(xì)胞，顯微鏡下每張濾膜隨機(jī)取5個(gè)視野,計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù),取平均數(shù)表示每組腫瘤細(xì)胞的遷移能力。

　　1.2.4 RTPCR檢測VEGF165轉(zhuǎn)染前后BGC823的MMP2、uPA mRNA表達(dá)變化 分組仍為對照組、AdGFP組和AdVEGF165組，按前述方法培養(yǎng)及感染細(xì)胞后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，無RNase水配制的電泳緩沖液及瓊脂糖凝膠電泳測定RNA的完整性。RNA電泳可見3條帶，分別為28、18、5 S亞基，28 S與18 S熒光強(qiáng)度之比為2∶1，說明RNA完整。按RTPCR試劑盒說明行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得細(xì)胞總cDNA，取3 μl cDNA行目的片斷DNA擴(kuò)增。PCR 引物序列及擴(kuò)增片段長度見表1。MMP2的反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s，50.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)后再于72 ℃ 延伸10 min。uPA的反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)后再于72 ℃ 延伸10 min。因所選PCR擴(kuò)增基因時(shí)選用的片段長度為230、324 bp，故選用的內(nèi)參照是擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為641 bp的β肌動蛋白(βactin)。βactin反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)后再于72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物立即進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠顯色，剩余產(chǎn)物-4 ℃冰箱保存。電泳時(shí)用的是600 bp的Marker。PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳后，紫外檢測儀下觀察DNA擴(kuò)增情況，用ImageMaster VDS掃描分析儀掃描凝膠圖譜，采用LabImage圖像分析系統(tǒng)(LabImage Version 2.7.1)進(jìn)行半定量分析，測量區(qū)帶密度，計(jì)算樣品的目的區(qū)帶與內(nèi)參區(qū)帶的密度比。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果中計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均采用Stata 9.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 表1 PCR 引物序列及擴(kuò)增片段長度

　　2 結(jié) 果

　　2.1 遷移實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

　　每個(gè)小室隨機(jī)抽取5個(gè)視野,計(jì)算每個(gè)視野的細(xì)胞總數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),AdVEGF165組胃癌細(xì)胞穿過微孔膜的細(xì)胞數(shù)明顯高于AdGFP組及對照組(P<0.05)，這提示在VEGF165轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞的體外遷移能力增強(qiáng),結(jié)果見表2、圖1。表2 各組穿過濾膜細(xì)胞數(shù)1)與對照組比較，P >0.05;2)與AdGFP組和對照組比較，P<0.05

　　2.2 RTPCR檢測BGC823的MMP2、uPA mRNA表達(dá) MMP2、uPA在3組細(xì)胞中均有表達(dá)。MMP2 mRNA在3組的表達(dá)分別為:對照組(0.380 3±0.025 4)、AdGFP組(0.409 6 ±0.066 8)、AdVEGF165組(0.664 6±0.048 6)(圖2)。AdVEGF165組的MMP2 mRNA的表達(dá)水平明顯高于對照組和AdGFP組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而后兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示AdVEGF165轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的BGC823后促進(jìn)了該細(xì)胞MMP2 mRNA的表達(dá)，而GFP對 BGC823的MMP2 mRNA的表達(dá)沒有影響。uPA mRNA在3組的表達(dá)分別為:對照組(0.404 3±0.062 0)、AdGFP組(0.406 0±0.115 8)、AdVEGF165組(0.821 6±0.079 8)(圖3)。AdVEGF165組uPA mRNA的表達(dá)水平明顯高于對照組和AdGFP組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而后兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示VEGF165轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的BGC823上調(diào)了該細(xì)胞uPA mRNA的表達(dá)，而GFP對BGC823的uPA mRNA的表達(dá)沒有明顯影響。1.對照組;2.AdGFP組;3.AdVEGF165組

　　3 討 論

　　VEGF是一種多功能的細(xì)胞因子，在血管形成及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。腫瘤細(xì)胞可以合成、分泌VEGF，在多種腫瘤細(xì)胞上都有VEGF受體的表達(dá)[1]。VEGF家族中包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE和胎盤生長因子六大成員，通常所說的VEGF即是指VEGFA。有研究表明,胃癌患者血漿VEGF的水平顯著高于正常人。胃癌患者血漿VEGF水平與胃癌分化程度、有無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。胃癌分化程度較差、有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者,血漿VEGF水平有顯著性增高[2]。Kondo等[3]研究了胃癌部分切除術(shù)后病人80例，用免疫組織化學(xué)方法測VEGFC和VEGFA蛋白表達(dá)，VEGFC和VEGFA陽性表達(dá)率分別為75例(93.8%)和41例(51.3%)，VEGFA表達(dá)與腫瘤分化(P=0.001 7)、血管侵犯(P=0.000 4)明顯相關(guān)，VEGFC陽性表達(dá)只與腫瘤分化有關(guān)系(P=0.016 8)，然而VEGFC和VEGFA同時(shí)表達(dá)者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯增加(P=0.036)。而且，兩者同時(shí)表達(dá)與腫瘤的浸潤深度、分化程度、淋巴管和血管侵犯明顯相關(guān)。Zhang等[1]報(bào)道在RF1、RF48、AGS1、NCIN87、NCISNU1、NCISNU5、NCISNU16和KATOⅢ等8個(gè)表達(dá)有VEGF121和VEGF165的胃癌細(xì)胞株中，有6個(gè)同時(shí)表達(dá)FLT1和KDR;而細(xì)胞株NCISNU5僅表達(dá)FLT1，KATOⅢ既不表達(dá)Flt1也不表達(dá)KDR，免疫組化顯示胃癌組織中Flt1和KDR陽性表達(dá)率高達(dá)84.6 %(44/52)及70 %，且外源性的VEGF以劑量依賴的方式刺激KDR陽性細(xì)胞株NCIN87和AGS1生長,但對KDR陰性的KATOⅢ細(xì)胞株則沒有作用。該研究提示，VEGF可能通過旁分泌和自分泌途徑促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長。

　　為此，我們利用Ad作為載體將VEGF165基因?qū)隑GC823，檢測VEGF165對其侵襲能力的影響，在前期實(shí)驗(yàn)中我們已將腺病毒重組體AdVEGF165進(jìn)行擴(kuò)增、純化后轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株BGC823，證實(shí)AdVEGF165成功導(dǎo)入BGC823后促進(jìn)了該細(xì)胞的VEGF及VEGFR2的表達(dá)，并證實(shí)其對胃癌細(xì)胞的促增殖作用[4]。本實(shí)驗(yàn)利用前期制備的高滴度AdGFP和AdVEGF165cDNA，并按MOI=20佳轉(zhuǎn)導(dǎo)率對胃癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AdVEGF165組細(xì)胞的體外遷移能力明顯高于AdGFP組及對照組，而AdGFP組及對照組之間比較無明顯差異，說明VEGF165能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的BGC823的遷移。

　　為再次確認(rèn)VEGF基因轉(zhuǎn)染增加胃癌細(xì)胞的侵襲性及其機(jī)制，我們應(yīng)用RTPCR檢測了轉(zhuǎn)染VEGF165基因前后侵襲相關(guān)分子MMP2和uPA的mRNA表達(dá)水平。腫瘤細(xì)胞浸潤擴(kuò)散過程中細(xì)胞基膜是一道天然屏障,腫瘤細(xì)胞必須要穿過細(xì)胞外基質(zhì)和基膜屏障才能進(jìn)一步侵入脈管、侵犯神經(jīng)或肌肉。在腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的過程中，降解和破壞細(xì)胞外基質(zhì)是關(guān)鍵步驟，基質(zhì)金屬蛋白酶在這一過程中起重要作用。MMP2是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中重要成員,是參與細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分Ⅳ型膠原降解的關(guān)鍵酶，對細(xì)胞外多種基質(zhì)均有降解作用，在腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制中扮演著極其重要角色。uPA系統(tǒng)不僅能直接降解細(xì)胞外基質(zhì)中大多數(shù)糖蛋白及蛋白多糖的蛋白核心部分，還能激活另一重要的基質(zhì)降解系統(tǒng)基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)，加強(qiáng)膠原、彈性蛋白等的降解，并與纖溶酶一起促使細(xì)胞外基質(zhì)和血管基質(zhì)降解，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[5]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在3組BGC823細(xì)胞株上均檢測到了MMP2、uPA的陽性表達(dá)，且AdVEGF165組陽性表達(dá)率高于對照組和AdGFP組，說明VEGF基因水平的增加可上調(diào)MMP2、uPA的mRNA表達(dá)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，VEGF基因?qū)δ[瘤生長和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用除了通過血管機(jī)制以外,也有對腫瘤細(xì)胞的直接作用。可以認(rèn)為VEGF在胃癌的侵襲性和惡性潛能方面的作用機(jī)制，部分是由于促進(jìn)MMP2和uPA的生成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)和血管基質(zhì)降解而實(shí)現(xiàn)的。

　　VEGF與MMP2、uPA三者之間的相互作用關(guān)系尚未明確。我們的實(shí)驗(yàn)提示，VEGF基因水平的增加可上調(diào)MMP2、uPA的mRNA表達(dá)。Shin等[6]在研究尼古丁對胃癌血管生成及腫瘤侵襲的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：侵襲和轉(zhuǎn)移過程中重要的細(xì)胞因子MMP2、MMP9活性及纖溶酶原激活物PA(uPA及其受體)的蛋白表達(dá)可被VEGF受體抑制劑降低。Sounni等[7]研究認(rèn)為，MMP2與VEGF在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中可能存在協(xié)同作用。Belotti等[8]認(rèn)為，在卵巢癌中MMP9和MMP2誘導(dǎo)VEGF釋放。進(jìn)一步闡明VEGF與MMP2、uPA三者間作用關(guān)系，對深入探討VEGF在胃癌侵襲中的意義及作用機(jī)制，早期診斷胃癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及其靶向治療有重要意義。